[發明專利]一種利用流式細胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法在審
| 申請號： | 202110234932.2 | 申請日： | 2021-03-03 |
| 公開（公告）號： | CN112980795A | 公開（公告）日： | 2021-06-18 |
| 發明（設計）人： | 宋興輝;楊堯順;王琳琳;李艷偉;邢月婷;王佳佳;黃瑩瑩;郭春 | 申請（專利權）人： | 浙江大學 |
| 主分類號： | C12N5/09 | 分類號： | C12N5/09;G01N15/14 |
| 代理公司： | 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283 | 代理人： | 何碧珩;卓彩霞 |
| 地址： | 310000 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 利用 細胞 分選 獲取 指定 粒徑 外泌體 分離 純化 方法 | ||
1.一種利用流式細胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，其特征是，包括以下步驟：
(1)設置儀器參數和選擇配件：使用流式細胞分選儀進行外泌體分選，使用50μm空氣噴射噴嘴，鞘液的壓力為75-80.5psi，樣品流的壓力與鞘液的壓力差值為0.3-0.6psi；閾值設置為0.01；
(2)利用聚苯乙烯珠，標定粒徑為50nm、100nm、200nm和500nm的外泌體顆粒的位置；
(3)利用流式細胞儀分離純化50-200nm粒徑的外泌體顆粒。
2.根據權利要求1所述的一種利用流式細胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，其特征是，步驟(1)中，設置儀器參數時，前向角和側向角使用對數參數。
3.根據權利要求1所述的一種利用流式細胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，其特征是，步驟(3)中，使用聚苯乙烯珠的稀釋液，其中稀釋倍數為1:1000。
4.根據權利要求1所述的一種利用流式細胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，其特征是，步驟(1)中，鞘液壓力設置為80psi。
5.根據權利要求1所述的一種利用流式細胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，其特征是，在步驟(1)之前，還包括獲得外泌體混合液的步驟。
6.根據權利要求5所述的一種利用流式細胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，其特征是，所述獲得外泌體混合液的步驟為：采用超速離心法從細胞上清液中獲得外泌體混合液。
7.根據權利要求6所述的一種利用流式細胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，其特征是，所述獲得外泌體混合液的步驟為：
P4代PANC-1細胞的融合度為75％時，用濃度為0.01M，pH為7.2-7.4的磷酸緩沖溶液潤洗PANC-1細胞，加入含體積分數10％無外泌體的胎牛血清的DMEM培養基，37℃培養48h后收集細胞上清液，采用超速離心法從細胞上清液中獲得外泌體混合液：
4℃，300×g離心10min，取上清液；然后再2 000×g離心10min，取上清液；再10 000×g離心30min，取上清液；再100 000×g離心70min，取沉淀，加入PBS緩沖液洗滌沉淀，100 000×g離心70min，取沉淀，用PBS緩沖液重懸得到外泌體混合液。
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