[發(fā)明專利]一種乙型腦炎病毒納米顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110233945.8
• 申請(qǐng)日: 2021-03-03
• 公開（公告）號(hào): CN112979826B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢平;李祥敏;姚慢慢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/66;A61K39/12;A61K39/385;A61K39/39;A61P31/14;C12R1/19
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發(fā)明提供了一種LS?ED3融合蛋白及其編碼基因和應(yīng)用，屬于獸用疫苗技術(shù)領(lǐng)域。一種LS?ED3融合蛋白包括乙型腦炎病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ和二氧四氫喋啶合酶多聚物蛋白。利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行融合基因的重組表達(dá)后獲得融合蛋白LS?ED3，電鏡觀察顯示能自組裝形成納米顆粒。得到的納米顆粒作為免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明LS?ED3融合蛋白可有效刺激體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高了乙型腦炎病毒ED3抗原的免疫原性和攻毒保護(hù)率。本發(fā)明利用原核表達(dá)的方式獲得的LS?ED3融合蛋白可以組裝形成納米顆粒，具備制備簡(jiǎn)單、成本低廉而且產(chǎn)量高、安全性好、特異性強(qiáng)、攻毒保護(hù)率高的特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乙型腦炎病毒納米顆粒疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)成員，是一種嗜神經(jīng)性蟲媒性人畜共患傳染病病原，感染人畜時(shí)誘發(fā)腦部炎癥和神經(jīng)損傷。豬是主要的擴(kuò)增宿主，感染豬時(shí)引起母豬流產(chǎn)，嚴(yán)重危害著人類健康及養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。

JEV的基因組為11KD左右的單股正連RNA，僅含一個(gè)開放閱讀框(ORF)，其能編碼由3400氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在宿主病毒蛋白酶和信號(hào)肽酶的切割加工下，由5'端讀碼區(qū)的前1/3編碼能產(chǎn)生3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)和囊膜糖蛋白(E)，7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、ANS4B、NS5。E蛋白為主要結(jié)構(gòu)蛋白，由500個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為53Ku，是主要的囊膜蛋白，含多個(gè)抗原決定簇，E蛋白在病毒毒力、誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答及產(chǎn)生中和抗體中起重要作用。E蛋白空間結(jié)構(gòu)分析表明，E蛋白含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：域I(也叫中心域)、域II和域III(Roehring et al.,1989)。結(jié)構(gòu)域Ⅰ有糖基化位點(diǎn)，并具有血清學(xué)和生物活性的抗原表位；結(jié)構(gòu)域Ⅱ具有中和活性和血凝活性抗原表位；結(jié)構(gòu)域Ⅲ含有大量特異表位，參與細(xì)胞受體結(jié)合過程，中和抗體表位主要集中于此結(jié)構(gòu)域。研究表明，JEV E結(jié)構(gòu)域III的中和位點(diǎn)主要集中在E337～345、E377～382、E397～403這3個(gè)區(qū)域內(nèi)(Roehring et al.,1989；Rey et al.,1995)。然而，可溶性單體抗原的免疫原性較低，因此需要開發(fā)一種新的安全高效的乙型腦炎納米顆粒疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種乙型腦炎病毒的LS-ED3融合蛋白，為非全病毒抗原，制備納米顆粒疫苗無病毒擴(kuò)散的危險(xiǎn)，生產(chǎn)過程較安全，同時(shí)具有較高的免疫原性，對(duì)小鼠保護(hù)率更高。

本發(fā)明的目的還在于提供了一種LS-ED3融合蛋白的編碼基因及其含所述編碼基因的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明提供了一種LS-ED3融合蛋白，所述融合蛋白包括乙型腦炎病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ和二氧四氫喋啶合酶多聚物蛋白。

優(yōu)選的，所述乙型腦炎病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述二氧四氫喋啶合酶多聚物蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

優(yōu)選的，所述融合蛋白還包括位于乙型腦炎病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ和二氧四氫喋啶合酶多聚物蛋白之間的連接肽linker2和位于所述融合蛋白3'端的his標(biāo)簽；所述his標(biāo)簽通過連接肽linker1與融合蛋白的3'端連接。

優(yōu)選的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明提供了一種所述LS-ED3融合蛋白的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10。

本發(fā)明還提供了一種含所述編碼基因的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：