[發明專利]一種乙型腦炎病毒納米顆粒疫苗及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110233945.8
• 申請日: 2021-03-03
• 公開（公告）號: CN112979826B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 錢平;李祥敏;姚慢慢
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/66;A61K39/12;A61K39/385;A61K39/39;A61P31/14;C12R1/19
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

1.一種LS-ED3融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括乙型腦炎病毒囊膜蛋白結構域Ⅲ和二氧四氫喋啶合酶多聚物蛋白；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根據權利要求1所述LS-ED3融合蛋白，其特征在于，所述乙型腦炎病毒囊膜蛋白結構域Ⅲ的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述二氧四氫喋啶合酶多聚物蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根據權利要求1或2所述LS-ED3融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白還包括位于乙型腦炎病毒囊膜蛋白結構域Ⅲ和二氧四氫喋啶合酶多聚物蛋白之間的連接肽linker2和位于所述融合蛋白3'端的his標簽；所述his標簽通過連接肽linker1與融合蛋白的3'端連接。

4.一種權利要求1～3任意一項所述LS-ED3融合蛋白的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10。

5.一種含權利要求4所述編碼基因的重組表達載體。

6.權利要求5所述重組表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)以JEV P3毒株基因組為模板，以第一引物進行PCR擴增，得到3'端含his標簽序列的ED3基因片段；

2)以二氧四氫喋啶合酶多聚物蛋白LS單體基因片段為模板，以第二引物進行PCR擴增，得到3'端含his標簽序列的LS基因片段；

3)將所述3'端含his標簽序列的ED3基因片段或3'端含his標簽序列的LS基因片段分別用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，酶切片段分別與同樣酶切后的pET28a連接，得到pET28a-ED3或pET28a-LS；

4)以所述pET28a-LS為模板，以第三引物進行PCR擴增，得到3'端帶有Linker2部分序列的LS基因片段LS-Linker2；

5)以所述pET28a-ED3為模板，以第四引物進行PCR擴增，得到5'端帶有Linker2部分片段的ED3基因片段Linker2-ED3；

6)以LS-Linker2基因片段和Linker2-ED3基因片段為模板，以第五引物進行擴增，得到LS-linker2-ED3-Linker1-His標簽的融合基因；

7)將所述LS-linker2-ED3-Linker1-His標簽的融合基因再次用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，得到的酶切產物與同樣酶切的pET28a載體連接，得到pET28a-LS-ED3；

其中步驟1)和2)之間沒有時間順序的限制；步驟4)和步驟5)之間沒有時間順序的限制。

7.根據權利要求6所述構建方法，其特征在于，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示；

所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；

所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示；

所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：5所示；

所述第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：5所示。

8.一種含權利要求5所述重組載體的重組菌株。

9.一種乙型腦炎病毒納米顆粒疫苗，其特征在于，包括佐劑IMS1313和權利要求1所述LS-ED3融合蛋白。