[發(fā)明專利]蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEV Nluc 2*2A的構建方法及其應用

在審

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• 申請日: 2021-03-03
• 公開（公告）號: CN112921008A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 鄭方亮;陳慶艷;王博;王瑩;霍雅鵬;胡媛媛;朱春玉
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/53;C12N15/63
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

本發(fā)明公開了蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEV Nluc 2*2A的構建方法及其應用。本發(fā)明構建出了含有Nluc2*2A報告基因的報告病毒，使可以通過檢測Nluc熒光素酶信號來監(jiān)測TBEV、研究病毒毒力，并且可作為抗病毒藥物篩選的有力工具。

技術領域

本發(fā)明涉及蜱傳腦炎病毒(TBEV)2*2A報告病毒的構建，特別涉及穩(wěn)定表達含有Nluc熒光素酶的報告病毒的構建及其應用。

背景技術

在中國，第一例人類蜱傳腦炎(TBE)病例于1943年被發(fā)現(xiàn)。TBE在中國的分布與其蜱媒的分布密切相關。我國TBE病例均為遠東亞型，由全溝硬蜱傳播。內蒙古大興安嶺、 黑海龍江小興安嶺、吉林省長白山林區(qū)是東北地區(qū)典型的TBE疫區(qū)。西北地區(qū)的新疆天山 北坡林區(qū)和阿爾泰南坡林區(qū)也有間歇性的TBE報告。此外，TBE在云南(中國西南部)和 西藏(中國西部)也有報道。

蜱傳腦炎病毒(TBEV)是黃病毒蜱傳類群中最重要的一種。TBEV有一個約11千堿基長的正鏈RNA基因組，基因組包括5'UTR和3'UTR以及一個開放閱讀框(Open readingframe，ORF)，基因組總共編碼3414個氨基酸，并翻譯成單個多蛋白，該多蛋白經(jīng)共轉錄 和轉錄后加工成三種結構蛋白(Structural protein，SP)和七種非結構蛋白(Non-structural protein，nSP)。其中，結構蛋白有C、PrM和E蛋白，非結構蛋白有NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。相比于其他黃病毒尤其是蚊媒病毒，蜱傳病毒研究相 對較少，很多功能是基于其他黃病毒的研究推理出的。

Nluc是熒光素酶系統(tǒng)家族的最新成員，可用于生物發(fā)光應用，這種小熒光素酶是從深 海蝦中提取的，并經(jīng)過人工優(yōu)化的一種熒光素酶，它的底物是呋喃嗪。Nluc分子量較小， 且該系統(tǒng)顯示出比FLuc和RLuc高150倍以上的活性，發(fā)光輸出保持穩(wěn)定，持續(xù)時間比其他的熒光素酶長。因此，在幾種熒光素酶中，Nluc基因在生物發(fā)光和報告基因的應用上都比其他熒光素酶更穩(wěn)定、更靈敏。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是構建出含有Nluc2*2A熒光素酶的蜱傳腦炎病毒的報告病毒，使其可以 在細胞中穩(wěn)定表達，并且可以通過檢測Nluc熒光素酶信號來研究病毒毒力，可作為抗病毒 藥物篩選的有力工具。

本發(fā)明采用的技術方案是：蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEV Nluc 2*2A的構建方法，包括 如下步驟：

1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV FL為模板，引物1和引物2為特異性引物，PCR 擴增蜱傳腦炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列為：

引物1：

5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；

引物2：

5’-CTCTCCGCTTCCCACGAGTCCATTTGGC-3’；

PCR反應體系(50ul)為：

PCR反應條件為：95℃預變性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min為一個循環(huán)，進 行35個循環(huán)，最后68℃延伸7min。

2)T2A和P2A序列與Nluc基因的連接：將T2A序列和P2A序列設計在引物上，并分 兩輪PCR將T2A和P2A序列連接到Nluc基因上。

第一輪PCR：以Nluc-pGEM T為模板，T2A Nluc F1和P2A Nluc R1為引物進行PCR，擴增好目的片段后，回收目的條帶。

引物T2A Nluc F1：

5’-CTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；