[發(fā)明專利]蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEV Nluc 2*2A的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110233874.1
• 申請日: 2021-03-03
• 公開（公告）號: CN112921008A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭方亮;陳慶艷;王博;王瑩;霍雅鵬;胡媛媛;朱春玉
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧大學(xué)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/53;C12N15/63
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEV Nluc 2*2A的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV FL為模板，引物1和引物2為特異性引物，PCR擴增蜱傳腦炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列為：

引物1：

5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；

引物2：

5’-CTCTCCGCTTCCCACGAGTCCATTTGGC-3’；

2)T2A和P2A序列與Nluc基因的連接：將T2A序列和P2A序列設(shè)計在引物上，并分兩輪PCR將T2A和P2A序列連接到Nluc基因上；第一輪PCR：以Nluc-pGEMT為模板，T2A Nluc F1和P2ANluc R1為引物進行PCR，擴增好目的片段后，回收目的條帶；進行第二輪PCR：以第一輪PCR回收的目的條帶為模板，T2A Nluc F2和P2A Nluc R2為引物進行PCR，擴增好目的片段后，回收目的條帶；并將第二輪PCR回收的目的條帶連接到pGEM T載體上，命名為Nluc 2*2ApGEM T；所述T2A Nluc F1、P2A Nluc R1、T2A Nluc F2和P2A Nluc R2的序列為：

引物T2A Nluc F1：

5’-CTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；

引物P2A Nluc R1：

5’-CAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCGCCAGAATGCGTTCGCAC-3’；

引物T2A Nluc F2：

5’-GGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTC-3’；

引物P2A Nluc R2：

5’-AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAG-3’；

3)T2A-Nluc-P2A片段的克隆：以Nluc 2*2A pGEM T為模板，引物3和引物4為特異性引物，擴增出T2A-Nluc-P2A片段；所述引物3和引物4的序列為：

引物3：

5’-CAAATGGACTCGTGGGAAGCGGAGAGGGCAGAG-3’；

引物4：

5’-CTTCCCGGCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTC-3’；

4)C1-AflⅡ片段的克隆：以TBEV FL為模板，引物5和引物6為特異性引物，擴增出C1-AflⅡ片段；所述引物5和引物6的序列為：

引物5：

5’-GAACCCTGGACCTATGGCCGGGAAGGCCATTC-3’；

引物6：

5’-CTTAAGCAACACTCCAGTCTGG-3’；

5)構(gòu)建SnaBI-C38-T2A-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段：以引物1和引物6為特異性引物，步驟1)獲得的SnaBI-C38片段、步驟3)獲得的T2-Nluc-P2A片段和步驟4)獲得的C1-AflⅡ片段為模板，通過重疊延伸PCR，將三個片段連接在一起，得到SnaBI-C38-T2A-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段；

6)將SnaBI-C38-T2A-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段和TBEV的感染性克隆用SnaBI和AflⅡ雙酶切，將酶切片段跑膠回收，再用T4連接酶進行連接，獲得蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEVNluc 2*2A。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEVNluc 2*2A的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1)SnaBI-C38片段的克隆中，PCR反應(yīng)體系為：TBEV FL 1ul，引物1和引物2各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO₄3ul，KOD1ul，ddH₂O 33ul，總體系50ul；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min為一個循環(huán)，進行35個循環(huán)，最后68℃延伸7min。