[發明專利]甬甜5號甜瓜種子純度的快速鑒定方法

有效

• 申請號: 202110232252.7
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN112961931B
• 公開（公告）日: 2023-01-10
• 發明（設計）人: 宋慧;丁偉紅;臧全宇;王毓洪;張香琴
• 申請（專利權）人: 寧波市農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 寧波成舟專利代理事務所(普通合伙) 33306
• 代理人: 高經

1.甬甜5號甜瓜種子純度的快速鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法包括用SSR1、SSR2和SSR3三對特異性引物對甬甜5號甜瓜單株的幼苗DNA進行PCR擴增；

所述SSR1、SSR2和SSR3特異性引物的序列信息分別如下：

SSR1：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

SSR2：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

SSR3：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

包括如下步驟：

（1）取樣

播種甬甜5號種子，待植株子葉平展，第一片新葉展開時，采集新葉1g，在-80℃下保存；

（2）DNA提取

采用CTAB法提取新鮮葉片總基因組DNA；

（3）PCR擴增

SSR1、SSR2和SSR3特異性引物分別獨立混樣，用于PCR擴增；

每對SSR特異性引物的混樣體系為15μl，包括1.5μl 濃度為2.5mM的dNTP，1.5ul 10×buffer，1.8ul 濃度為25mM的MgCl₂，2ul 濃度為5mM的引物，其中每對SSR特異性引物的兩條序列分別添加1.0ul，5ul濃度為10ng/ul的DNA，1U的Taq 0.05ul，3.145ul超純水；

PCR擴增程序為：預變性94℃ 1min；變性93℃ 1min，退火50℃ 1min，延伸72℃ 2min，進行40個循環；延伸72℃ 1min；

（4）PCR產物檢測

使用2.5%高分辨率標準凝膠瓊脂糖，添加20 μl溴化乙錠顯色，在PCR產物中加入2μlLoading Dye，電泳2-3小時，電壓200v，電泳結束后，利用凝膠成像系統觀察結果；

（5）數據收集與分析；

（6）計算種子純度。

2.根據權利要求1所述的甬甜5號甜瓜種子純度的快速鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法還包括用所述SSR1、SSR2或SSR3特異性引物對鑒定的不純合親本進行擴增、提高親本純度的步驟。

3.根據權利要求2所述的甬甜5號甜瓜種子純度的快速鑒定方法，其特征在于，當雜株表現為母本P1的多態性位點，父本P2對應位點不純合時，用SSR1、SSR2或SSR3引物對不純合父本P2進行擴增，剔除與P2多態性位點不同的單株。

4.根據權利要求1所述的甬甜5號甜瓜種子純度的快速鑒定方法，其特征在于，每個單株的擴增產物經瓊脂糖電泳分離、溴化乙錠染色后，檢測多態性；通過觀察擴增產物在標記多態性位點的差異特點判斷該單株是否為雜種。

5.根據權利要求1所述的甬甜5號甜瓜種子純度的快速鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法還包括如下步驟：

（7）親本純度提高

將檢出的甬甜5號甜瓜雜株的擴增帶型與親本帶型比對，當雜株表現為母本P1的多態性位點，父本P2對應位點不純合時，用SSR1、SSR2或SSR3引物對不純合父本P2進行擴增，剔除與P2多態性位點不同的單株，提高親本純度。