[發明專利]一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝

在審

• 申請號: 202110231891.1
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN113004363A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 劉宗文;雍金貴;錢鑫
• 申請（專利權）人: 通用生物系統（安徽）有限公司
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07H1/00
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 劉生昕

1.一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：具體包括以下步驟：

步驟一、制備合成柱，合成柱的內部填充有載體和CPG，將準備好的合成柱填塞入合成板中，并在合成板上標記合成批次號；

步驟二、檢查合成試劑量和所在位置以及合成儀的狀態，打開合成程序，導入Headpiece-primer序列，啟動合成程序開始合成，合成時采用固相亞磷酰胺三酯法，從Headpiece-primer的3’端向5’端依次合成，每個循環將一個亞磷酰胺單體與上一循環連接在固相載體上的產物通過3'到5'磷酸二酯鍵相連，合成過程中，正常DMT被洗脫的顏色呈橘紅色；

步驟三、將合成的帶有Headpiece-primer的合成柱浸泡在氨水中，加熱氨水至70-90攝氏度，浸泡30-50分鐘，連接在CPG上的Headpiece-primer被切割下來，得到產物a；

步驟四、對產物a進行純化處理，得到Headpiece-primer；

步驟五、取Headpiece-primer溶解在硼酸鹽緩沖溶液中，攪拌混合均勻，得到基礎液b；

步驟六、首先向基礎液b中加入AOP，再加入DMT-MM，室溫條件下靜置10-12小時，得到AOP-Headpiece-primer粗品；

步驟七、向AOP-Headpiece-primer粗品中加入NaCl溶液和冰乙醇溶液，將混合液放置在零下20攝氏度1小時，離心處理收集沉淀物，對沉淀物進行凍干處理，得到凍干粉，將凍干粉投入哌啶水溶液中進行脫保護，對脫保護產物用乙醇離心洗滌除去溶劑和哌啶，最后通過高效液相色譜法去除雜質，得到AOP-Headpiece-primer目的產品。

2.根據權利要求1所述的一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：步驟一中，對制備的合成柱進行質量檢查，確保合成柱中載體完整，CPG不外漏。

3.根據權利要求1所述的一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：步驟二中，每個循環分為四步，具體如下：

步驟A1、脫保護：連接在固相載體上的保護基團DMT與三氯乙酸反應被脫去，得到游離的5’羥基；

步驟A2、活化和偶聯：亞磷酰胺單體與活化劑混合，得到3’端被活化的亞磷酸中間體，亞磷酸中間體與固相載體上游離的5’羥基發生縮合反應；

步驟A3、蓋帽：用乙酸酐和1-甲基咪唑封閉未參與縮合反應的5’羥基，使5’羥基無法在后續步驟中參與反應；

步驟A4、氧化：在碘的氧化作用下，不穩定的亞磷酸酯被氧化成穩定的磷酸三酯。

4.根據權利要求1所述的一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：步驟二中，通過合成中正常DMT被洗脫顏色的深淺判斷循環之前的合成效率。

5.根據權利要求1所述的一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：步驟四中，對得到的Headpiece-primer進行標準檢測，要求Headpiece-primer質譜顯示的純度大于90％。

6.根據權利要求1所述的一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：步驟五中，Headpiece-primer和硼酸鹽緩沖溶液的消耗質量比為1:3.2，且硼酸鹽溶液的pH值為9.4。

7.根據權利要求1所述的一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：步驟六中，AOP與DMT-MM的消耗質量比為1:1。

8.根據權利要求1所述的一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：步驟七中，NaCl溶液和冰乙醇溶液的消耗質量比為2:1，哌啶水溶液的消耗量為凍干粉總質量的2.5倍。

9.根據權利要求1所述的一種用于DNA編碼化合物庫建庫接頭的生產工藝，其特征在于：步驟七中，對得到的AOP-Headpiece-primer目的產品進行標準檢測，要求AOP-Headpiece-primer目的產品質譜顯示的純度大于90％，且HPLC純度和CGE純度大于90％。