[發(fā)明專利]基因多段重復的連接克隆方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110231338.8
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN113005119A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 雍金貴;崔康樂;王維坤;駱曉雯;紀世春
• 申請（專利權(quán)）人: 通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/64
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 劉生昕

1.基因多段重復的連接克隆方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S1、將引物Primer 3gggacctttatatgggctgtta和Primer4GGTCTCacagaacactacttcctataa通過PCR擴增模板得到B片段；

步驟S2、用二類酶FaqI和BsaI雙酶切第一步的PCR擴增得到的B片段；BsaI單酶切克隆載體V；

步驟S3、將步驟S2酶切的PCR產(chǎn)物和載體V等比混合，之后加入T4 DNA連接酶連接，制得連接產(chǎn)物；

步驟S4、將步驟S3制得的連接產(chǎn)物導入感受態(tài)細胞，涂布LB+KanR平板、培養(yǎng)；

步驟S5、菌落PCR驗證以及提取質(zhì)粒進行測序驗證。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多段重復的連接克隆方法，其特征在于，步驟S1中PCR擴增的具體步驟為：

第一步、稱取如下原料：1xPCR緩沖液，1-2mM MgCl₂，200-400nMPrimer3gggacctttatatgggctgtta、200-400nMPrimer4GGTCTCacagaacactacttcctataa，0.05-0.2mM dNTP，1-2U聚合酶；

第二步、將DNA模板、引物、聚合酶、dNTP、1xPCR緩沖液和MgCl₂混合構(gòu)成PCR體系，之后經(jīng)過預變性，變性、退火和延伸三個步驟的循環(huán)，延伸，將Primer3gggacctttatatgggctgtta和Primer4GGTCTCacagaacactacttcctataa進行擴增，制得B片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因多段重復的連接克隆方法，其特征在于，第二步中預變性的溫度為90-96℃，預變性時間為2-5min，變性的溫度為90-96℃，變性時間為15-30s，退火溫度為50-56℃，退火時間為15-30s，延伸溫度為70-75℃，延伸時間為15-30s，依次循環(huán)26次，之后在65-75℃延伸5-10min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多段重復的連接克隆方法，其特征在于，步驟S4中涂布LB+KanR平板、培養(yǎng)的具體為步驟為：

第一步、稱取胰化蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，將胰化蛋白胨、酵母粉和氯化鈉依次加入800mL雙蒸水溶解，用玻璃棒攪拌均勻，攪拌均勻后加入濃度為1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，直至pH＝7.4，之后定容至1L，調(diào)節(jié)pH為7.4，之后分裝在錐形瓶，向錐形瓶中加入瓊脂，瓊脂的用量為培養(yǎng)基重量的2％，加入卡那霉素，配置出的濃度為30mg/mL，之后在120-125℃下高溫高壓滅菌30min，之后在經(jīng)過紫外殺菌1h的無菌操作臺上，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，放置在無菌操作臺上，直至瓊脂凝固，涂平板；

第二步、用移液槍吸取100μL轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞于平板上，用酒精燈滅菌后的涂抹棒劃十字，涂布平板，涂布結(jié)束后將培養(yǎng)皿置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。