[發明專利]基因多段重復的連接克隆方法

在審

• 申請號: 202110231338.8
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN113005119A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 雍金貴;崔康樂;王維坤;駱曉雯;紀世春
• 申請（專利權）人: 通用生物系統（安徽）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/64
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 劉生昕

本發明公開一種基因多段重復的連接克隆方法，包括如下步驟：步驟S1、將引物通過PCR擴增模板得到B片段；步驟S2、用二類酶FaqI和BsaI雙酶切第一步的PCR擴增得到的B片段；BsaI單酶切克隆載體V；步驟S3、將步驟S2酶切的PCR產物和載體V等比混合，之后加入T4DNA連接酶連接，制得連接產物；步驟S4、將步驟S3制得的連接產物導入感受態細胞，涂布LB+KanR平板、培養；步驟S5、菌落PCR驗證以及提取質粒進行測序驗證；使用引物Primer3和Primer4擴增模板，成功擴增出特異性單一條帶，并且可用于下一步酶切連接。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體為基因多段重復的連接克隆方法。

背景技術

如圖1所示，由于目的片段B的5’端基因多處重復，無法直接設計PCR首尾引物Primer 1/2將目的擴增出來(因為Primer 1有4處結合位點，出現非特異性擴增)，然后重組或者連接入目的載體，同時也無酶切位點進行切割，造成基因克隆困難。

二類酶，切割位點和識別位點不唯一，通常用于酶切連接常用酶。此技術背景即利用二類酶這一特性進行克隆連接操作，如圖2示例二類酶FaqI酶切示意圖；

如圖3-5所示，以FaqI為例，識別位點gggac，間隔10堿基之后進行切割，那么我們可以利用這一點，設計引物Primer 1為F正向引物進行擴增，通過在引物5’端加上二類酶識別位點gggac，此引物則不會與模板出現錯配現象，二類酶的識別位點gggac其它區域為引物與模板的結合位點，那么我們就可以將B片段PCR擴增下來，之后利用FaqI酶切PCR產物(圖3)，連接進入預先設計好的目標載體BsaI酶切相同的粘性末端，完成無縫克隆。

發明內容

為了克服上述的技術問題，本發明提供一種基因多段重復的連接克隆方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

基因多段重復的連接克隆方法，包括如下步驟：

步驟S1、將引物Primer 3gggacctttatatgggctgtta和Primer4GGTCTCacagaacactacttcctataa通過PCR擴增模板得到B片段；

步驟S2、用二類酶FaqI和BsaI雙酶切第一步的PCR擴增得到的B片段；BsaI單酶切克隆載體V；

步驟S3、將步驟S2酶切的PCR產物和載體V等比混合，之后加入T4 DNA連接酶連接，制得連接產物；

步驟S4、將步驟S3制得的連接產物導入感受態細胞，涂布LB+KanR平板、培養；

步驟S5、菌落PCR驗證以及提取質粒進行測序驗證。

進一步地，步驟S1中PCR擴增的具體步驟為：

第一步、稱取如下原料：1xPCR緩沖液，1-2mM MgCl₂，200-400nMPrimer3gggacctttatatgggctgtta、200-400nMPrimer4GGTCTCacagaacactacttcctataa，0.05-0.2mM dNTP，1-2U聚合酶；

第二步、將DNA模板、引物、聚合酶、dNTP、1xPCR緩沖液和MgCl₂混合構成PCR體系，之后經過預變性，變性、退火和延伸三個步驟的循環，延伸，將Primer3gggacctttatatgggctgtta和Primer4GGTCTCacagaacactacttcctataa進行擴增，制得B片段。

進一步地，第二步中預變性的溫度為90-96℃，預變性時間為2-5min，變性的溫度為90-96℃，變性時間為15-30s，退火溫度為50-56℃，退火時間為15-30s，延伸溫度為70-75℃，延伸時間為15-30s，依次循環26次，之后在65-75℃延伸5-10min。