[發明專利]一種結核分枝桿菌整合型表達質粒及其應用

有效

• 申請號: 202110230211.4
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN113549642B
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 畢利軍;張陽萍;李平俊;張晴
• 申請（專利權）人: 體必康生物科技（廣東）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/56;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/32
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 劉瑤云

本發明涉及一種結核分枝桿菌整合型表達質粒及其應用，所述的質粒包括如下結構元件：(1)抗性基因的篩選標記，用于重組質粒的構建和篩選；(2)分別位于抗性基因兩側的γδ序列，用于抗性進行敲除；(3)用于目的基因插入及表達的元件；(4)必要的標簽元件，復制子元件以及結核分枝桿菌基因組整合元件。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體的，涉及一種結核分枝桿菌整合型表達質粒及其應用。

背景技術

結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病，結核病仍是嚴重威脅人類健康的傳染病之一。BCG是唯 一被批準用于結核病預防的疫苗，但BCG對成人的保護效果不穩定，圍繞重組分枝桿菌研發保護性疫苗 如重組BCG疫苗的研究一直是結核疫苗研究熱點。

常規的通過在結核分枝桿菌基因組中整合特定的過表達蛋白，最終得到無抗型重組結核分枝桿菌效率 很低，重組菌的構建需要1年甚至更長時間。采用本方法構建整合型過表達重組分枝桿菌能夠極大提高效 率，為加速分枝桿菌功能基因組的研究提供了新的遺傳工具，為無抗且特定抗原含量較高的抗結核疫苗或 預防結核疫苗研發提供了極大的便利。

目前構建整合到基因組上的不含抗性的分枝桿菌的過表達菌株，需要的步驟大致如下：

(1)構建含抗性的整合型的過表達質粒；

(2)篩選構建成功的質粒后再轉入分枝桿菌中；

(3)經過抗性和表達篩選獲得含抗性基因的過表達菌株，

(4)構建敲除抗性質粒，構建敲除抗性噬菌體，獲得不含抗性的分枝桿菌的過表達菌株。

可見，傳統方法中，構建一個完整的基因過表達且抗性敲除的重組分枝桿菌菌株，至少要做4次質粒 構建，每一次構建都需要重復酶切和連接轉化、篩選等繁瑣步驟，此外，由于分枝桿菌生長緩慢的特性使 得這一過程常常需要1年甚至更長時間，導致傳統方法效率極低，極大的限制了研究進程。

發明內容

本發明首先涉及一種結核分枝桿菌整合型表達質粒，所述的質粒包括如下結構元件：

(1)抗性基因的篩選標記，用于重組質粒的構建和篩選；

(2)分別位于抗性基因兩側的γδ序列，用于抗性進行敲除；

(3)用于目的基因插入及表達的元件；

(4)必要的標簽元件，復制子元件以及結核分枝桿菌基因組整合元件。

所述的γδ序列如SEQ ID NO.33所示。

優選的，

所述的抗性基因為SacB和hyg抗性基因；

所述的用于目的基因插入及表達的元件為hsp60 promoter；

所述的標簽元件為his標簽，所述的復制子元件為用于在大腸桿菌中傳代OIE復制子，所述的結核分 枝桿菌基因組整合元件為attp和int基因；

最優選的，

所述的質粒為pTB01質粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明還涉及所述的結核分枝桿菌整合型表達質粒的如下應用：

(1)制備基因組中整合了特定過表達蛋白的結核分枝桿菌菌株；

(2)制備特定抗原含量較高的抗結核疫苗或預防結核疫苗。

一種制備基因組中整合了過表達型目標蛋白的結核分枝桿菌菌株的方法，所述的方法包括如下步驟：

(1)將目標蛋白的表達基因插入到所述的結核分枝桿菌整合型表達質粒中；