[發(fā)明專利]一種結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒及其應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202110230211.4 | 申請(qǐng)日： | 2021-03-02 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN113549642B | 公開（公告）日： | 2023-03-07 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 畢利軍;張陽(yáng)萍;李平俊;張晴 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 體必康生物科技（廣東）股份有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12N15/74 | 分類號(hào)： | C12N15/74;C12N15/56;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/32 |
| 代理公司： | 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102 | 代理人： | 劉瑤云 |
| 地址： | 528300 廣東省佛山市順德區(qū)樂(lè)從鎮(zhèn)興樂(lè)社區(qū)*** | 國(guó)省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 結(jié)核 分枝桿菌 整合 表達(dá) 質(zhì)粒 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒包括如下結(jié)構(gòu)元件：
(1)抗性基因的篩選標(biāo)記，用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選；所述的抗性基因?yàn)镾acB和hyg抗性基因；
(2)分別位于抗性基因兩側(cè)的γδ序列，用于抗性進(jìn)行敲除；所述的γδ序列如SEQ IDNO.33所示；
(3)用于目的基因插入及表達(dá)的元件；所述的用于目的基因插入及表達(dá)的元件為hsp60promoter；
(4)必要的標(biāo)簽元件，復(fù)制子以及結(jié)核分枝桿菌基因組整合元件；所述的標(biāo)簽元件為his標(biāo)簽，所述的復(fù)制子為oriE基因，所述的結(jié)核分枝桿菌基因組整合元件為attp和int基因；
所述的質(zhì)粒為pTB01質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒的如下應(yīng)用：
(1)制備基因組中整合了特定過(guò)表達(dá)蛋白的結(jié)核分枝桿菌菌株；
或者(2)制備特定抗原含量較高的抗結(jié)核疫苗或預(yù)防結(jié)核疫苗；
所述菌株或者疫苗中含有特定目標(biāo)蛋白高表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒，所述特定目標(biāo)蛋白高表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒分別為：
包含Rv3899c蛋白的pBT01s1-Va07質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.2所示；包含Rv0287蛋白的pBT01s1-Va16質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.5所示；包含Rv3803c蛋白的pBT01s1-Va25質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.8所示。
3.一種制備基因組中整合了過(guò)表達(dá)目標(biāo)蛋白的結(jié)核分枝桿菌菌株的方法，所述的方法包括如下步驟：
(1)將目標(biāo)蛋白的表達(dá)基因插入到權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒中；
(2)擴(kuò)增并提取該含有目標(biāo)蛋白的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒；
(3)將所述含有目標(biāo)蛋白的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入結(jié)核分枝桿菌中；
所述含有目標(biāo)蛋白的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒分別為：
包含Rv3899c蛋白的pBT01s1-Va07質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.2所示；包含Rv0287蛋白的pBT01s1-Va16質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.5所示；包含Rv3803c蛋白的pBT01s1-Va25質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.8所示。
4.一種制備特定目標(biāo)蛋白高含量的結(jié)核疫苗的方法，所述的方法包含如下步驟：
(1)將目標(biāo)蛋白的表達(dá)基因插入到權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒中；
(2)擴(kuò)增并提取該含有目標(biāo)蛋白的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒；
(3)將所述含有目標(biāo)蛋白的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入結(jié)核分枝桿菌中；
(4)以步驟(3)得到的結(jié)核分枝桿菌制備所述疫苗；
所述的含有目標(biāo)蛋白的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒分別為：
包含Rv3899c蛋白的pBT01s1-Va07質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.2所示；包含Rv0287蛋白的pBT01s1-Va16質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.5所示；
包含Rv3803c蛋白的pBT01s1-Va25質(zhì)粒，序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一組以權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體制備得到的特定目標(biāo)蛋白高表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒，所述的特定目標(biāo)蛋白高表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌整合型表達(dá)質(zhì)粒分別為：
包含Rv3899c蛋白的pBT01s1-Va07，序列如SEQ ID NO.2所示；
包含Rv0287蛋白的pBT01s1-Va16，序列如SEQ ID NO.5所示；
包含Rv3803c蛋白的pBT01s1-Va25，序列如SEQ ID NO.8所示。
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