[發明專利]一種快速、同時檢測食品中大腸桿菌O157:H7和鼠傷寒沙門氏菌的方法

有效

• 申請號: 202110230131.9
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN113373247B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 李會;孔嘉琪;趙靚;廖小軍;陳愛亮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所;中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/10;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京中建聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11004
• 代理人: 王靈靈;晁璐松

本發明提供了一種快速、同時檢測食品中大腸桿菌O157:H7和鼠傷寒沙門氏菌的方法，以待檢測食品樣本為模板直接進行擴增，利用ddPCR同時檢測食品中的大腸桿菌O157:H7和鼠傷寒沙門氏菌；待檢測食品樣本中菌液濃度換算公式為cfu/mL=copies/μL×20μL/加樣量×1000μL。相比現有技術，本發明所述方法省略了DNA的提取步驟，直接以細菌為模板進行ddPCR檢測，提高了食品中致病菌檢測的效率；并且通過實驗數據證實，直接加入完整的細菌而非提取的DNA也能夠具有很強的抗干擾能力和極高的靈敏度。

技術領域

本發明屬于微生物檢測技術領域，特別涉及一種快速、同時檢測食品中大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的方法。

背景技術

微滴式數字聚合酶鏈式反應技術(droplet digital polymerase chainreaction,dd PCR)，又稱為“第三代PCR技術”，是一種能夠對目標核酸進行定性定量的新型檢測方法。ddPCR技術可分為三個步驟：微滴的生成、微滴PCR擴增、微滴熒光信號判讀。首先將帶有熒光標記的樣品反應體系進行稀釋，通過液滴生成卡生成上萬個油包水的微小液滴，每個液滴中至少包含一個待檢核酸分子，或者不存在待檢核酸分子；在PCR反應過程中，每一個微滴可以視為一個獨立的反應體系進行PCR擴增，可以將待檢核酸分子的信號值放大，PCR擴增結束后，利用微滴分析儀對每個微滴進行逐一檢測，有熒光信號的判讀為“1”，無熒光信號的判讀為“0”，代表目標核酸的存在與否。最后，基于泊松分布原理和陽性微滴的比例，便可以計算出待檢核酸分子的起始拷貝數，從而實現對原始反應體系中核酸靶分子數的絕對定量。

相比于傳統的PCR技術和qPCR技術，ddPCR的檢測不需要標準品，能夠直接建立陽性微滴與原始濃度之間的函數關系，從而實現對目標核酸的絕對定量。與此同時，通過對樣品的有限稀釋和微滴化處理，能夠有效降低背景DNA的干擾，提高檢測的靈敏度和抗干擾性。

近年來，ddPCR的應用也在不斷擴大，包括檢測各類病原體、監測食品安全和水質、鑒別食源性成分摻假、轉基因成分的檢測和評估等等。在食源性致病菌檢測領域，目前利用ddPCR技術進行檢測的方法包括：細菌培養、設計特異性熒光PCR引物、人工污染食品樣本、DNA提取與分離，以及ddPCR的檢測等步驟。該方法需要從食品中提取致病菌DNA，在細菌DNA的提取過程中，會造成基因片段的斷裂和部分基因的損失，不僅檢測時間長、效率低，而且對于低濃度致病菌的檢測，會影響檢出結果的精確度；另外，該方法需要用高濃度的致病菌純培養物人工污染食品樣本，經過人工富集步驟后再提取DNA，無法直接對低濃度的污染樣本直接進行取樣。

因此，如何能夠利用ddPCR技術快速、準確的檢測食品中的致病菌，進一步提高檢測精度，是目前急需解決的問題。

發明內容

為解決現有技術中的上述問題，本發明的目的在于簡化ddPCR食源性致病菌的檢測步驟、提高檢測精度，提供一種快速、同時檢測食品中大腸桿菌O157:H7和鼠傷寒沙門氏菌的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種快速、同時檢測食品中大腸桿菌O157:H7和鼠傷寒沙門氏菌的方法，其中，以待檢測食品樣本為模板直接進行擴增，利用ddPCR同時檢測食品中的大腸桿菌O157:H7和鼠傷寒沙門氏菌；

所述待檢測食品樣本為經過離心或浸泡處理后，提取獲得的待測食品中的菌體樣本；

待檢測食品樣本中菌液濃度換算公式為cfu/mL＝copies/μL×20μL/加樣量×1000μL。

進一步的，所述ddPCR中的擴增體系為：

進一步的，對目標菌為大腸桿菌O157:H7的引物對為：