[發(fā)明專利]一種細(xì)胞色素P450單加氧酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110230094.1
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN112961844B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 石金田;許國超;賈煊杰;倪曄;鄭香玉
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12P33/00;C12P33/06;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開了一種細(xì)胞色素P450單加氧酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的細(xì)胞色素P450單加氧酶突變體L84Q/D93A對石膽酸的羥化活力為5.6U/mg，是野生型CYP活力的42.4倍，具有較高的催化活性和穩(wěn)定的催化效果，隨著底物濃度的提升至500mmol/L，L84Q/D93A仍然能在24h將石膽酸進(jìn)行完全轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明所述細(xì)胞色素P450單加氧酶及其基因具有很好的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞色素P450單加氧酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

熊去氧膽酸(UDCA)，化學(xué)名為3a,7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸，為白色粉末狀固體，分子式為C₂₄H₄₀O₄，分子量為392.57，CAS號為128-13-2，熔點(diǎn)為203℃，沸點(diǎn)為547℃，幾乎不溶于水。

熊去氧膽酸已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，用于治療治療膽結(jié)石、膽汁淤積性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障礙、膽囊炎、膽道炎和膽汁性消化不良、膽汁返流性胃炎、眼部疾病等。熊去氧膽酸的合成有化學(xué)法和生物法兩種。其中化學(xué)合成法一般采用從膽酸出發(fā)七步合成或從非膽酸類甾體出發(fā)來完成熊去氧膽酸的制備，此兩種方法都存在反應(yīng)收率低、產(chǎn)物純度低、生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)，難以工業(yè)化生產(chǎn)。與化學(xué)法相比，生物法具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益較高等優(yōu)點(diǎn)。生物法包括動力學(xué)拆分和合成。

生物合成法研究較多的是用野生菌或重組工程菌的整細(xì)胞或游離酶進(jìn)行催化。Catherine Juste等報道了從人體排泄物中分離得到的五種菌都能將鵝脫氧膽酸轉(zhuǎn)化為熊去氧膽酸，經(jīng)過基因序列比對確定這五種菌都是Clostridium baratii。五種菌在培養(yǎng)48h后，熊去氧膽酸最高產(chǎn)率為75.9％，最低產(chǎn)率為52.0％；Ian A.Macdonald等人成功分離8種野生菌(Clostridium absonum)，它們都同時包含7α-和7β-HSDH，利用這些野生菌能將膽酸轉(zhuǎn)化成熊膽酸或?qū)ⅨZ脫氧膽酸轉(zhuǎn)化成熊脫氧膽酸。但是整細(xì)胞轉(zhuǎn)化膽酸或鵝脫氧膽酸的濃度分別低于1.5mM和0.5mM，更高濃度則會抑制細(xì)胞生長和底物轉(zhuǎn)化。分別培養(yǎng)15-22h和9-15h后產(chǎn)率為60-70％；SergioRiva等報道了從膽酸一鍋煮合成12-羰基-熊去氧膽酸的方法，反應(yīng)中混合了五種酶，其中三種酶是：7α-HSDH克隆自B.fragilis菌株、12α-HSDH來源于未知序列的商業(yè)途徑和7β-HSDH克隆自C.absonum，其中前兩種酶起氧化作用，屬于NADH依賴型，7β-HSDH起氧化作用，屬于NADPH依賴性，通過不同的輔酶依賴性，結(jié)合不同的輔酶循環(huán)實(shí)現(xiàn)一鍋煮。為了NAD⁺的再生，采用了乳酸脫氫酶/丙酮酸系統(tǒng)，同樣為了NADP⁺的再生，采用了來源于Thermoplasma acidophilum的高度NADPH依賴性的葡萄糖脫氫酶。反應(yīng)5h之后膽酸完全轉(zhuǎn)化為12-羰基-熊去氧膽酸，但是24h之后又有中間產(chǎn)物出現(xiàn)，所以沒有實(shí)現(xiàn)真正的一鍋煮；DirkWeuster-Botz等研究將3α-HSDH和7β-HSDH以及FDH的基因整合到一個質(zhì)粒上，研究了他們之間在質(zhì)粒上不同位置對產(chǎn)酶的影響。利用新構(gòu)建的整細(xì)胞催化脫氫膽酸合成12-羰基-熊去氧膽酸，可以在21h內(nèi)將70mM的脫氫膽酸99％轉(zhuǎn)化為12-羰基-熊去氧膽酸。該批產(chǎn)品分離后的純度是95％。

然而，以上方法僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，且存在羥化酶的自身活力低，產(chǎn)物濃度不高，步驟繁瑣以及酶熱穩(wěn)定性差等缺陷，不適合工業(yè)化生產(chǎn)熊去氧膽酸。因此，篩選活力高，且能在較短時間內(nèi)獲得較高產(chǎn)物濃度的細(xì)胞色素P450單加氧酶，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)熊去氧膽酸的需求具有非常重要的意義，本實(shí)驗(yàn)室篩選得到一種細(xì)胞色素P450單加氧酶，催化石膽酸生產(chǎn)熊去氧膽酸，底物石膽酸濃度達(dá)到50mmol/L，反應(yīng)24h，產(chǎn)物摩爾收率為95.9％，光學(xué)純度為99％(R)，但是底物濃度依然達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種細(xì)胞色素P450單加氧酶突變體，活力較野生型有較大程度的提高，且底物濃度能夠達(dá)到500mmol/L。