[發明專利]一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測CYP2C9和VKORC1基因多態性的試劑盒

在審

• 申請號: 202110228740.0
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN112899361A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 陳大為;陳龍;張瑤
• 申請（專利權）人: 濟南國益生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 濟南信在專利代理事務所(特殊普通合伙) 37271
• 代理人: 殷盛江

本申請屬于生物檢測技術領域，具體為一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測CYP2C9和VKORC1基因多態性的試劑盒；所述引物和探針組分為兩組，A組為檢測CYP2C9*2和*3的引物對、野生型探針和突變型探針；B組為檢測VKORC1?1639GA的引物對、野生型探針和突變型探針；所述試劑盒包括含有擴增反應試劑A的檢測管、含有擴增反應試劑B的檢測管、緩沖液、醋酸鎂、陽性對照、陰性對照。

技術領域

本申請屬于生物檢測技術領域，具體為一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測CYP2C9和 VKORC1基因多態性的試劑盒。

背景技術

華法林是臨床常用的抗凝藥物，它通過抑制肝細胞中凝血因子的合成，對抗有凝血功能的維生素K的作用，降低凝血酶誘導的血小板聚集反應，從而起到抗凝作用，主要用于防治血栓栓塞性疾病。但華法林臨床使用治療窗窄，個體劑量差異大，容易導致出血不良反應。藥物基因組學研究表明，VKORC1和CYP2C9基因多態性是華法林個體化治療中最重要的因素，美國FDA建議在使用華法林前檢測CYP2C9和VKORC1的基因型，以保證準確的用藥量。因此，病人在首次服用華法林之前檢測CYP2C9和VKORC1基因多態性，對患者的療效獲益及避免出血等不良事件的發生有重要的指導意義。

華法林在肝臟中的代謝依賴于細胞色素P450，故CYP2C9基因多態性會對華法林的劑量產生影響。CYP2C9最常見的突變是CYP2C9*2(rs1799853，430CT)和CYP2C9*3(rs1057910， 1075AC)，突變導致CYP2C9酶活性降低，使其底物的清除率降低，血藥濃度升高，因此需降低臨床用藥劑量，防止不良反應的發生。亞洲人群發現的主要是CYP2C9*3突變，發生率為1％-4％，CYP2C9*2突變在亞洲人中很少出現。

VKORC1是維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶，是華法林等香豆素類抗凝藥物的作用靶點。在VKORC1編碼區和非編碼區存在大量的多態性位點，VKORC1啟動子的基因多態性(rs9923231，-1639GA)是影響華法林需求劑量中種族差異和個體差異的最主要因素。研究表明，VKORC1-1639GA等位基因頻率在不同種族人群分布不同，AA純合子基因型亞洲人頻率最高，非洲裔美國人頻率最低，歐洲人居中，而攜帶純合子突變AA基因型的患者需要的華法林劑量更低一些。

目前，針對CYP2C9和VKORC1基因多態性的檢測方法很多，如熒光定量PCR法、限制性片段長度多態性分析法、高分辨率溶解曲線法、直接測序、基因芯片等。但是這些方法基本上都操作復雜、檢測周期長，且需要復雜的儀器設備、成本也較高，不適合臨床推廣。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技術是一種核酸等溫擴增技術，主要依賴重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶三種酶。RMA反應可以在37～42℃進行，整個過程在30min內即可達到檢測水平。鎖核酸(LockedNucleicAcid，LNA)是一種特殊的雙環狀寡核苷酸衍生物，其結構中核糖的2'-O位和4'-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環形，這個環形橋鎖定了呋喃糖C3'-內型的N構型，降低了核糖結構的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結構的穩定性，提高了擴增反應中DNA分子的穩定性和親和力。研究發現，在錯配位點修飾1-3個鎖核酸可明顯提高單堿基錯配的識別能力。LNA修飾的探針比傳統的DNA探針有更高的靈敏度、穩定性、擴增效率和較低的探針濃度，是一種更為可靠的檢測基因分型的方法。

本發明采用鎖核酸修飾的重組酶介導的等溫擴增法(LNA-RMA法)進行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，更加快速、簡便，能夠提高單堿基突變檢測的特異性和靈敏度。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本申請提供了一種基于鎖核酸修飾的RMA法檢測CYP2C9 和VKORC1基因多態性的試劑盒，本申請是通過下述方案實現的：