[發明專利]一種泉水魚精子高效超低溫冷凍保存方法

在審

• 申請號: 202110227761.0
• 申請日: 2021-03-01
• 公開（公告）號: CN112715534A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 胡鵬;呂云云;劉德;周曉莉;胡燕;謝尚君
• 申請（專利權）人: 內江師范學院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

本發明屬生物技術領域，具體地說是一種泉水魚精子高效超低溫冷凍保存方法。將泉水魚的精液與抗凍液按體積比1:30的比例混合，混合后經過三步程序降溫處理，最終投入到液氮(?196℃)，分裝保存；抗凍液由稀釋液、抗凍劑和添加劑三部分組成。本發明獲得的凍精對于泉水魚人工繁育、種質保存、遺傳多樣性保護及可持續養殖等方面有著重要意義。

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體地說是一種泉水魚精子高效超低溫冷凍保存方法。

技術背景

泉水魚(Semilabeoprochilus)屬鯉形目，鯉科，野鯪亞科，泉水魚屬的一種魚類。泉水魚是中國特有的物種。體較長，前部圓，后部稍側扁，腹前部較平，頭的背部成弧形。吻圓鈍；口裂略呈三角形，上、下唇在口角處相連，唇上有許多排列整齊的小角質凸起；唇部卷入口腔內，張口時，唇外翻擴展為喇叭形，借此吸附于其它物體上。唇后溝限于口角處。須2對，吻須較長，頜須短小。眼小，位于頭側稍后上方。鱗中等大，腹部鱗較小，且陷藏于皮下。背鰭無硬刺。體背部灰黑色，腹部灰白色，各鰭微黑；體側鱗片絕大部分都有黑色邊緣，從鰓孔之后至胸鰭前黑色的斑塊較粗，故此聯成一大形黑斑。

泉水魚棲息于我國南方江河流速較大的水域的中下層，平時喜歡生活于山溪和具流水的巖洞，以及江河有泉源的地方。常以口在江底巖石上刮食附著的動植物及其它有機物質，很少進入地層為污泥的靜水水體中，生殖季節游向上游產卵。一般長至重1-1.5公斤始達性成熟。產卵時間約在3-4月，卵產于石縫或石洞中。

泉水魚分布于長江上游干、支流及珠江水系的西江中上游。泉水魚是四川、廣西、云南常見食用魚類。生長速度比較慢，常見者大約0.5-1公斤，最大個體大約3.5-4公斤左右。產量也不大，惟其肉質細嫩，肉味十分鮮美，且富含脂肪為食用之珍品。鮮肉供藥用。有補益元氣、止血的功效。主治泄痢、吐血、崩漏等癥，具有較高的營養價值。近年來，由于養殖規模的不斷擴大，加之對泉水魚種質需求的不斷擴大，泉水魚的精子冷凍技術急需建立起來。魚類精液的超低溫保存在水產養殖、遺傳育種以及種質資源保存中具有重要的意義：可以使種質的長距離運輸得以實現，有利于魚類的雜交、選育以及基因多樣性的保護。隨著我國經濟的飛速發展及海水污染的日益加劇，重要淡水養殖優良品種種質保存已成為我國淡水養殖業中亟待解決的問題。建立泉水魚精子的超低溫冷凍技術，無論是對其遺傳多樣性的保護，還是開展生物技術育種以及淡水養殖業的可持續發展，都有著迫切的需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種泉水魚精子高效超低溫冷凍保存方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

將泉水魚的精液與抗凍液按體積比1:30的比例混合，混合后經過程序降溫處理，最終投入到液氮(-196℃)，分裝保存；抗凍液由稀釋液、抗凍劑和添加劑三部分組成，其中稀釋液由NaCl、KCl、CaCl₂·6H₂O、NaHCO₃、葡萄糖和果糖組成，抗凍劑為30％(V/V)甲醇，添加劑是15％(V/V)蜂蜜。

所述稀釋液由NaCl、KCl、CaCl₂·6H₂O、葡萄糖和果糖組成：制備方法為取NaCl1.5g，KCl 0.01g，CaCl₂·6H₂O 0.1g，NaHCO₃0.1g，葡萄糖8.5g，果糖3.0g，溶于800mL雙蒸水，熱壓消毒，冷卻，定容至1000mL，即成稀釋液。

所述抗凍液是將抗凍保護劑與稀釋液混合，制成比例為30％甲醇(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱備用。

將新鮮的泉水魚精液與抗凍液按照1:30的體積比混合均勻，移液槍吸取2mL混合液加入到2.5mL的凍存管中。

用移液槍吸取300μL新鮮蜂蜜加入到凍存管中，充分混勻，隨后放入4℃冰箱預冷5min。