[發明專利]SPL3和miR156基因在鑒定抗從枝病泡桐的應用

在審

• 申請號: 202110227237.3
• 申請日: 2021-03-01
• 公開（公告）號: CN112941221A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 范國強;翟曉巧;趙振利;王哲
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種抗叢枝病泡桐的早期分子鑒定方法，其中，包含獲取泡桐葉片RNA；PCR檢測并分析miR156和SPL3的表達量；預判其抗病性。本發明首次對抗叢枝病泡桐進行早期鑒定，該發明有助于抗叢枝病泡桐的選育，在泡桐育種上有巨大價值。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，更具體地說是涉及一種抗叢枝病泡桐的早期鑒定方法。

背景技術

泡桐，又叫白花泡桐、大果泡桐，空桐木等，樹皮灰色、灰褐色或灰黑色，幼時平滑，老時縱裂。假二杈分枝，單葉，對生，葉大，卵形，全緣或有淺裂，具長柄，柄上有絨毛；喜光，較耐陰，喜溫暖氣候，耐寒性不強。其生長速度快，耐瘠薄，材性優良，在防風固沙、保障糧食安全和木材供應等方面起著重要的作用。

泡桐叢枝病是泡桐生產中最嚴重的病害之一，感病的幼苗、幼樹常于當年枯死，大樹感病后會引起樹勢衰退，材積生長量大幅度下降甚至造成死亡。目前，，叢枝病的防治目前費時費力，培育抗叢枝病的泡桐品種才是預防的根本，因此，開展抗叢枝病泡桐的選育是有必要的。

因此，如何對抗叢枝病泡桐進行早期的分子鑒定是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明以SPL3和miR156基因在泡桐樹中的表達量為指標對抗從枝病的泡桐進行鑒定，簡單高效。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

SPL3和miR156基因在以Real-Time PCR方法鑒定抗從枝病泡桐中的應用。

miR156的靶基因為SPL，miR156和SPL特定存在于植物中，對于維持植物的生長發育、非生物脅迫和合成代謝具有關鍵作用，miR156對SPL3具有調控作用，而且miR156對SPL3的調控主要通過SPL3蛋白翻譯后的抑制來實現的，所以在同一時期，植物體內miR156和SPL3基因的表達量呈相反趨勢。MiR156通過切割SPL3轉錄本來影響枝條分支和植物構型。miR156的過表達促進了腋芽的萌生和生長，同時抑制了SAM的活性，導致了矮化植物的表型。SPL3通過影響獨腳金內酯的信號傳導進而調控植物的分枝。在選育過程中，miR156表達量較低同時SPL3表達量較高的候選植株，其出現叢枝癥狀的可能性較低。

一種鑒定抗從枝病泡桐的引物，以SPL3和miR156基因進行鑒定，且所述引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；

miR156F-5P-qF：GACAGAAGATAGAGAGCACAA，如SEQ ID NO.1所示；

miR156F-5P-qR：GeneCopoeia公司的All-in-One^TMmiRNA qRT-PCR DetectionKit試劑盒配有下游通用引物Universal AdaptorPCR Primer；

pau-SPL3-qF:TTCTGTCATCTAACTCTTG，如SEQ ID NO.2所示；

pau-SPL3-qR:CCTCATCACTGGATTATAG，如SEQ ID NO.3所示。

一種抗叢枝病泡桐的早期分子鑒定方法，包括下述步驟：

(1)獲取泡桐葉片：在同樹齡泡桐樣地，用高枝剪取待鑒定泡桐頂芽下部第一輪葉片；

(2)泡桐RNA抽提：采用研磨法提取泡桐葉片RNA，并用分光光度計評估RNA樣品的純度和濃度，最后純化RNA樣品，并將RNA保存在-80℃以備后用；

(3)合成cDNA：用Surescript^TMcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄反應，反應結束后，85℃滅活處理5min，-20℃保存反轉錄產物待用；