[發明專利]一種差向異構酶的突變體，其編碼基因、氨基酸序列及其應用

有效

• 申請號: 202110226700.2
• 申請日: 2021-02-27
• 公開（公告）號: CN112921025B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 范超;齊佳琨;袁文杰;袁堂國;洪皓;劉軍;吳文忠
• 申請（專利權）人: 大連醫諾生物股份有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12P19/24;C12P19/02
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司 21238
• 代理人: 劉曉琴

本發明公開了一種差向異構酶的突變體、其編碼基因、氨基酸及在生產D?阿洛酮糖中的應用，具體是通過基因工程方法獲得了差向異構酶突變體；在提高了差向異構酶突變體的熱穩定性同時，使酶的最適溫度提高了10?20℃，并且該突變體在不需要金屬離子就能發揮很好的催化效果，大大降低了生產成本，同時突變體在D?果糖?硼酸溶液中具有更高的催化效率，該方法為酶法工業化生產D?阿洛酮糖提供有效途徑。

技術領域

本發明涉及一種酶突變體，特別涉及一種差向異構酶的突變體、其編碼基因、氨基酸及在生產D-阿洛酮糖中的應用。

背景技術

D-阿洛酮糖是D-果糖的碳-3異構體，是一種罕見的單糖，存在于天然產物中。近年來，D-阿洛酮糖因其健康益處而受到廣泛關注，包括作為低熱量甜味劑、肝臟脂肪生成酶和腸道酶糖苷酶的抑制劑減少身體脂肪積累。自然界中，D-阿洛酮糖的含量極少，且極難獲得。來源于野生菌株未經改造的差向異構酶在熱穩定性方面較差，工業應用存在一定的局限性，導致酶的使用時間偏短，應用成本偏高，限制了D-阿洛酮糖的大規模工業化生產。因此，熱穩定性好的差向異構酶的資源仍然偏少，不利于D-阿洛酮糖的工業化應用推廣。

目前已經有多項關于差向異構酶的突變體提高催化果糖生成阿洛酮糖效率或效果的專利申請。專利CN201911384895.2、CN201911378513.5、CN201911204720.9等通過點突變得到耐高溫的酶，但最適溫度過高，不利于工業生產，最適溫度下半衰期短，酶回收利用的價值不大；專利CN201810059404.6、CN201610816801.4、CN201911099450.X等通過點突變和隨機突變等方式使酶的半衰期有所延長，其熱穩定性有所提高，但反應平衡并沒有明顯右移，其轉化率依然在30％左右。CN201910655539.3得到的突變體酶活有了顯著提升，但是其最適溫度沒有提高，此溫度下底物和產物的溶解度有限，限制了工業上高濃度底物的生產，不利于工業放大。

因此，如何同時提高差向異構酶的熱穩定性以及提高其生產D-阿洛酮糖的效率，使其能夠在較高底物濃度下進行催化反應，為酶法工業化生產D-阿洛酮糖提供有效途徑是當前亟需解決的技術問題。

發明內容

針對現有技術中的不足之處，本發明通過基因工程方法獲得了差向異構酶突變體；在提高了差向異構酶突變體的熱穩定性同時，使酶的最適溫度提高了10-20℃，并且該突變體在水中就能發揮很好的催化效果，不需要其他緩沖溶液存在，該方法為酶法工業化生產D-阿洛酮糖提供有效途徑。

本發明第一方面提供了一種差向異構酶突變體，所述突變體的氨基酸序列如SEQID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

本發明第二方面提供了一種差向異構酶突變體，所述突變體的核苷酸序列如SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示；或者所述突變體的基因序列為編碼前文所述的差向異構酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

本發明第三方面提供了一種差向異構酶突變體的構建方法，包括如下步驟；按照隨機突變試劑盒獲得隨機突變體，篩選其中具有優良性能的突變體。該方法中所述試劑盒為市面上可購買到的任意QuickMutationTM基因隨機突變試劑盒。

本發明第四方面提供了一種差向異構酶突變體在生產D-阿洛酮糖中的應用。

進一步地，所述應用包括將細胞用于D-阿洛酮糖生產的催化體系中進行反應。

進一步地，所述D-阿洛酮糖生產的催化體系包括100～1000g/L果糖，0～576g/L硼酸，前文所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的突變體的全細胞濃度15～45g/L；優選的全細胞濃度為25～35g/L。

進一步地，所述D-阿洛酮糖生產的催化體系溫度控制在65～90℃范圍內，反應pH可在6.5～8.5范圍內波動，硼酸濃度可在72～288g/L范圍內波動，D-果糖可在200～800g/L范圍內波動；