[發明專利]一株通過還原TCA途徑生產己二酸的工程菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 202110226378.3
• 申請日: 2021-03-01
• 公開（公告）號: CN113046283B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 鄧禹;周勝虎;郝婷婷;毛銀;李國輝;趙運英
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/65;C12N15/52;C12N15/53;C12P7/44;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一株通過還原TCA途徑生產己二酸的工程菌株及其構建方法，屬于代謝工程領域。本發明以還原TCA途徑和逆己二酸降解途徑為基礎，通過過表達相關基因進行途徑強化以及基因表達水平層面的優化，從而獲得了一株具有較大潛力的己二酸生產菌株。本發明對于提高己二酸的產率具有強有力的理論依據，提高了碳源的利用率，減少了二氧化碳的排放，己二酸產量達到0.3g/L，所述方法為其他高附加值有機酸生產菌株的代謝重組提供了方法借鑒。

技術領域

本發明涉及一株通過還原TCA途徑生產己二酸的工程菌株及其構建方法，屬于代謝工程領域。

背景技術

三羧酸循環(Tricarboxylic?acid?cycle,TCAcycle)是生物體內最活躍的代謝途徑，是脂肪，糖類，氨基酸三大類營養素的代謝樞紐。有氧條件下，生物體主要通過正向的氧化TCA循環完成一系列的酶促反應，在厭氧條件下，逆向的還原TCA途徑會被激活來合成細胞所需要的重要原料。相比于氧化TCA循環存在的兩步會造成碳原子流失的脫羧步驟，還原TCA循環由于其關聯的固碳步驟，碳原子的利用率得到了顯著提高。還原TCA途徑憑借其較高的理論產率已被大量應用于生產蘋果酸，富馬酸，琥珀酸等有機酸。

己二酸是一種重要的六碳二元羧酸，已被廣泛地用于生產尼龍6,6等工業用品。通過化學法生產己二酸面臨嚴峻的能源匱乏及環境污染等問題，因此尋求綠色的可持續發展的生物合成方法迫在眉睫。半生物法合成己二酸主要包括生物法合成己二酸前體物質以及前體物質通過化學催化轉換為己二酸這兩個步驟，然而化學催化過程貴金屬鉑的使用大大增加了生產成本，所以此方法很難適用于大規模的工業化。隨著合成生物學及代謝工程的發展，全生物法合成己二酸的策略被大量地報道與應用，例如逆β氧化途徑，脂肪酸的ω-氧化，α-酮酸途徑等，然而，這些途徑大都由于產率低很難得到進一步的放大生產。值得關注的是，目前，通過來源于Thermobifidafusca的逆己二酸降解途徑全生物合成己二酸實現了大腸桿菌中己二酸的最高報道產量。

逆己二酸降解途徑合成己二酸的兩個主要前體物質為琥珀酰輔酶A和乙酰輔酶A，其中，琥珀酰輔酶A作為TCA循環的代謝中間產物既可以由氧化TCA途徑產生，也可以由還原TCA途徑產生。當琥珀酰輔酶A通過氧化TCA途徑產生時，由于異檸檬酸轉化為α-酮戊二酸和α-酮戊二酸轉化為琥珀酰輔酶A均為脫羧步驟，碳原子以二氧化碳形式的排放導致當以葡萄糖為底物進行生物合成己二酸時，己二酸的理論產率僅為54.07％。所以，雖然已有的報道己二酸的實際產率已經達到了理論產率的93％，但較低的理論產率限制了己二酸產量的進一步提高。因此，依賴于生物代謝網絡，開發一種致力于提高碳源利用率的工程代謝途徑，對于獲得己二酸高產菌株具有重要的現實意義。

發明內容

技術問題：

目前通過氧化TCA途徑偶聯逆己二酸降解途徑生產己二酸的理論產率最高僅為54.07％，限制了己二酸產量的進一步提高；合成代謝途徑碳源不能被完全利用。

技術方案：

本發明第一個目的是提供一種通過還原TCA途徑偶聯逆己二酸降解途徑生產己二酸的工程菌株。

在一種實施方式中，以大腸桿菌為出發菌株，過表達編碼琥珀酰輔酶A合成酶α亞基的基因sucD，富馬酸還原酶的基因frdABCD。

在一種實施方式中，所述工程菌株還過表達了編碼丙酮酸羧化酶的基因pyc。

在一種實施方式中，所述基因sucD的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述基因frdABCD的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

在一種實施方式中，所述大腸桿菌為E.coli?Mad1415。

在一種實施方式中，所述工程菌株是以pACM4G質粒為載體。