[發明專利]一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法

在審

• 申請號: 202110223268.1
• 申請日: 2021-03-01
• 公開（公告）號: CN112870229A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 張雪梅;王婷;郭孟洋;陳樂
• 申請（專利權）人: 河南省銀豐生物工程技術有限公司;銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K49/00;A61P19/02;C12N5/0775;G16B40/00
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 嚴海晨

本發明公開了一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法，包括制備血小板裂解液、人臍帶MSCs分離及培養、人臍帶MSCs移植和療效評定。本發明的有益效果是：確保制備細胞的活性，保證細胞存活數量可以用于實驗研究，且防止部分細胞殘余在培養瓶內，提高細胞計數的準確性，確認了MSCs治療能明顯改善膝骨關節炎患者疼痛，且效果優于傳統的透明質酸治療法，根據實驗數據，可以選出最佳治療次數，為今后在人臍帶間間充質干細胞治療膝骨關節炎提供科學依據。

技術領域

本發明涉及一種間充質干細胞制劑研究方法，具體為一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法，屬于化學醫療技術領域。

背景技術

骨關節炎是一種嚴重危害人類健康的慢性骨關節疾病，細胞治療骨關節炎近年來發展較快，并得到了廣泛關注，臍帶來源的間間充質干細胞治療骨關節炎既具有其他來源間間充質干細胞擴增分化容易，具有抗炎和招募作用等優勢，又具有細胞年輕化、獲得量大、無倫理問題、取材過程無痛苦、高增殖特性、多能分化特性、低免疫源性、無致瘤性等特點，是目前臨床細胞治療最常用的種子細胞。

間間充質干細胞 中間間充質干細胞治療骨關節炎的優勢在于具有組織來源廣泛、擴增分化容易、分化的細胞具有組織特異性、具有抗炎和招募作用、低成瘤風險、免疫原性低等特點，但目前的臨床隨機對照試驗數量有限，尚需要進一步的臨床研究證實其療效。

發明內容

本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的：一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法，包括以下步驟：

步驟A：制備血小板裂解液，取患者靜脈血300ml后，離心獲取血小板裂解液，-80℃低溫保存，備用；

步驟B：人臍帶MSCs分離及培養，在超凈臺內將臍帶用無菌生理鹽水沖洗干凈，剪成小于1mm³的組織塊碎后放入離心管中，將組織塊平鋪于10個T75培養瓶底部，加入含無血清培養基，置于37℃、含5%二氧化碳飽和濕度的恒溫培養箱中，6天后培養液全量換液一次，鏡下觀察是否有細胞從組織塊周圍爬出，以后每3天換液一次，直至可見細胞爬出且密度達70-80%，可以考慮進行傳代操作；

步驟C：人臍帶MSCs移植，將受試者隨機分為治療組和對照組各10例，兩組在性別構成、年齡及病程等方面無顯著學差異，治療組每月注射2×10⁷cells/4mL，連續注射3個月，對照組進行玻璃酸鈉25mg膝關節腔注射治療，期間獲取關節液；

步驟D：療效評定，進行WOMAC總評分和膝關節lequesne指數評分。

作為本發明再進一步的方案：所述步驟B中，細胞鏡下觀察生長且密度達70-80%時，開始進行傳代操作，輕輕拍打培養瓶側壁，使組織塊完全脫落下來，將含有組織塊的培養上清液棄掉，用PBS沖洗培養瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL預熱的0.05%胰酶，待顯微鏡下細胞變圓后，用舊培養液終止消化，輕輕吹打，吸取細胞懸液于離心管中，1500rpm/min，4℃離心5min，收集細胞，并計數，以5×10³/cm2的接種密度進行傳代。

作為本發明再進一步的方案：所述步驟C中，每次移植前1周關節腔注射4ml解凍后激活的血小板裂解液，移植前選擇存活率不低于90%，且無EBV、HBV、HCV、HIV污染的細胞進行復蘇且臨用前行胰蛋白酶收集、激活的血小板裂解液重懸處理后混勻分裝。

作為本發明再進一步的方案：所述步驟C中，在進行膝關節注射時，常規消毒、鋪洞巾，持5ml無菌注射器進入關節腔后抽出適量關節液，保留針頭，拔出針筒，連接上裝有混勻MSCs的針筒，緩慢注4ml，術畢無菌紗布壓迫覆蓋針眼，仰臥20min，期間間斷屈伸膝關節數十次，MSCs移植1晚后再次注射4ml解凍后激活的血小板裂解液。