[發明專利]一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法

在審

• 申請號: 202110223268.1
• 申請日: 2021-03-01
• 公開（公告）號: CN112870229A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 張雪梅;王婷;郭孟洋;陳樂
• 申請（專利權）人: 河南省銀豐生物工程技術有限公司;銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K49/00;A61P19/02;C12N5/0775;G16B40/00
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 嚴海晨

1.一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟A：制備血小板裂解液，取患者靜脈血300ml后，離心獲取血小板裂解液，-80℃低溫保存，備用；

步驟B：人臍帶MSCs分離及培養，在超凈臺內將臍帶用無菌生理鹽水沖洗干凈，剪成小于1mm³的組織塊碎后放入離心管中，將組織塊平鋪于10個T75培養瓶底部，加入含無血清培養基，置于37℃、含5%二氧化碳飽和濕度的恒溫培養箱中，6天后培養液全量換液一次，鏡下觀察是否有細胞從組織塊周圍爬出，以后每3天換液一次，直至可見細胞爬出且密度達70-80%，可以考慮進行傳代操作；

步驟C：人臍帶MSCs移植，將受試者隨機分為治療組和對照組各10例，兩組在性別構成、年齡及病程等方面無顯著學差異，治療組每月注射2×10⁷cells/4mL，連續注射3個月，對照組進行玻璃酸鈉25mg膝關節腔注射治療，期間獲取關節液；

步驟D：療效評定，進行WOMAC總評分和膝關節lequesne指數評分。

2.根據權利要求1所述的一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法，其特征在于：所述步驟B中，細胞鏡下觀察生長且密度達70-80%時，開始進行傳代操作，輕輕拍打培養瓶側壁，使組織塊完全脫落下來，將含有組織塊的培養上清液棄掉，用PBS沖洗培養瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL預熱的0.05%胰酶，待顯微鏡下細胞變圓后，用舊培養液終止消化，輕輕吹打，吸取細胞懸液于離心管中，1500rpm/min，4℃離心5min，收集細胞，并計數，以5×10³/cm2的接種密度進行傳代。

3.根據權利要求1所述的一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法，其特征在于：所述步驟C中，每次移植前1周關節腔注射4ml解凍后激活的血小板裂解液，移植前選擇存活率不低于90%，且無EBV、HBV、HCV、HIV污染的細胞進行復蘇且臨用前行胰蛋白酶收集、激活的血小板裂解液重懸處理后混勻分裝。

4.根據權利要求1所述的一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法，其特征在于：所述步驟C中，在進行膝關節注射時，常規消毒、鋪洞巾，持5ml無菌注射器進入關節腔后抽出適量關節液，保留針頭，拔出針筒，連接上裝有混勻MSCs的針筒，緩慢注4ml，術畢無菌紗布壓迫覆蓋針眼，仰臥20min，期間間斷屈伸膝關節數十次，MSCs移植1晚后再次注射4ml解凍后激活的血小板裂解液。

5.根據權利要求1所述的一種用于治療膝骨關節炎的間充質干細胞制劑及其研究方法，其特征在于：所述步驟D中，利用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，治療前后均在醫生指導下完成10mm的VAS24項WOMAC量表評分，但不得替代患者做評分，詳細記錄各項分數，且治療前后分別進行膝關節Lequesne指數評分，用于膝關節骨關節炎的嚴重程度、疾病活動及膝關節功能的判斷。