[發(fā)明專利]HPSEC-MALS法檢測多糖并與Sepharose CL-4B法關(guān)聯(lián)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110222592.1
• 申請日: 2021-02-25
• 公開（公告）號: CN112986457B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李茂光;李亞南;毛琦琦;陳蘇京;王春娥;趙丹;許美鳳;葉強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/74
• 代理公司: 北京安信方達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262
• 代理人: 徐愛文;張奎燕

HPSEC?MALS法檢測多糖并與Sepharose CL?4B法關(guān)聯(lián)的方法，利用高效分子排阻色譜柱，采用高效分子排阻色譜?多角度激光散射儀(HPSEC?MALS)方法，測定多糖分子大小及其分布，并將其轉(zhuǎn)化為瓊脂糖凝膠(Sepharose)CL?4B法的K_D值和回收率。該方法與Sepharose CL?4B法線性相關(guān)性高，對原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改動(dòng)小，并且用時(shí)短，樣品用量少，提供了新的測定多糖分子大小及分布的方法和標(biāo)準(zhǔn)，為多糖疫苗的研究、檢驗(yàn)及申報(bào)提供參考，為發(fā)展更為高效的分子大小測定方法提供數(shù)據(jù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本文涉及將通過HPSEC-MALS法測定的多糖分子大小及其分布，特別是多糖重均分子量和累積分子量分布轉(zhuǎn)換為Sepharose CL-4B法的多糖K_D值和回收率的方法。

背景技術(shù)

多糖疫苗是重要的一種疫苗類型，如包括腦膜炎球菌多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗等。其中，莢膜多糖是由帶有莢膜的細(xì)菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)、提取純化其莢膜多糖抗原而得。其在培養(yǎng)和純化過程中形成重復(fù)單元數(shù)量不同的一系列分子量不均一的多糖混合物。莢膜多糖也是多糖蛋白結(jié)合疫苗的基礎(chǔ)，如腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗等。其中，分子大小是影響多糖免疫原性的重要指標(biāo)，并且分子大小的分布是與免疫原性相關(guān)的重要物理化學(xué)參數(shù)，疫苗效力的安全可靠也依賴于免疫化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)的一致性，其中一個(gè)決定性的參數(shù)就是多糖分子的大小分布。研究發(fā)現(xiàn)分子量大于等于90000g/mol的葡聚糖具有良好的免疫原性，而小于等于50000g/mol的葡聚糖免疫原性較弱(參見KabatEA,Bezer A E.The effect of variation inmolecularweight on the antigenicity of dextran in man[J].Arch Biochem.Biophys,78:306-318,1958)。

《中國藥典》2020版三部采用瓊脂糖凝膠CL-4B(Sepharose CL-4B)法檢測細(xì)菌莢膜多糖在色譜柱中的分配系數(shù)K_D值和多糖在K_D值小于0.5以前的回收率來控制多糖質(zhì)量。但是，該方法存在耗時(shí)長、易受人為因素影響導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定的缺陷。近年來，人們發(fā)現(xiàn)高效分子排阻色譜-多角度激光散射儀(high performance size exclusion chromatography-Multiangle laser-light scattering，HPSEC-MALS)聯(lián)用法具有高效、穩(wěn)定等的特點(diǎn)。該方法通過分析激光照射樣品溶液中的顆粒物產(chǎn)生的散射光特性來確定樣品的分子特征，可不使用任何分子量標(biāo)準(zhǔn)品直接測定樣品的重均分子量(weight-average molecular weight，Mw)。

雖然現(xiàn)有技術(shù)中記載了采用HPSEC-MALS法對多糖分子進(jìn)行分析，然而并未系統(tǒng)的公開使用HPSEC-MALS法控制多糖質(zhì)量的具體方法，也并未公開或指出HPSEC-MALS法的檢測結(jié)果與Sepharose CL-4B法標(biāo)準(zhǔn)之間的關(guān)系，缺乏將兩者快速有效關(guān)聯(lián)的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本申請?zhí)峁┝艘环N利用HPSEC-MALS法檢測多糖分子大小及其分布，并將其轉(zhuǎn)換為瓊脂糖凝膠(Sepharose)CL-4B標(biāo)準(zhǔn)的方法，具體地，該方法將通過高效分子排阻色譜-多角度激光散射儀(HPSEC-MALS)測得的多糖重均分子量和累積分子量分布(cumulativeweight fraction，C_WF)與SepharoseCL-4B法的多糖K_D值和回收率之間建立線性回歸，該方法具有線性相關(guān)性高，對原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改動(dòng)小，用時(shí)短，樣品用量少的特點(diǎn)。因此，提供了新的測定多糖分子大小及分布的標(biāo)準(zhǔn)，為多糖疫苗的研究、檢驗(yàn)及申報(bào)提供參考，為發(fā)展更為高效的分子大小測定方法提供數(shù)據(jù)支持。

本申請涉及一種HPSEC-MALS法檢測多糖分子大小及其分布轉(zhuǎn)換為SepharoseCL-4B法標(biāo)準(zhǔn)的方法，所述方法包括：