[發明專利]一種重組質粒、包含其的基因工程菌及其在制備碳酸二甲酯中的應用

在審

• 申請號: 202110220540.0
• 申請日: 2021-02-26
• 公開（公告）號: CN112961871A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 尹斌;牟新東;石健;劉濤;王文久
• 申請（專利權）人: 源創核新（北京）新材料科技有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/20;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 北京金信知識產權代理有限公司 11225
• 代理人: 李雪芹;張皓

1.一種重組質粒，其在酶切位點EcoRI和HindIII之間包含用于表達脂肪酶突變體的核苷酸序列，其中所述序列選自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9。

2.一種如權利要求1所述的重組質粒的制備方法，所述方法包括：

1)將PEL編號為GenBank:AF284064.1的基因序列通過全基因合成，并連接在質粒pET-28a上，酶切位點為EcoRI和HindIII，獲得質粒pET28a-PEL；

2)以質粒pET28a-PEL為模板，以下列引物對之一進行高保真PCR擴增：

引物對1：

正向:5’GCTCTCATCACTCCTGTGCTCTCGGGCGTGACT 3’(SEQ ID NO：1)反向:5’AGTCACGCCCGAGAGCACAGGAGTGATGAGAGC 3’(SEQ ID NO：2)；

引物對2：

正向:5’ACTTTCCCCTCTAATGTGAAGATCATG 3’(SEQ ID NO：5)反向:5’CATGATCTTCACATTAGAGGGGAAAGT 3’(SEQ ID NO：6)；

3)PCR之后通過瓊脂糖電泳驗證PCR產物大小，異丙醇沉淀回收PCR產物，DpnI酶切去除模板，轉化大腸桿菌后提取得到包含E83V或D92N突變酶基因的重組質粒，

或者

所述方法包括：在上述步驟3)之后，進一步以與前次所用引物對不同的引物對重復步驟2)和3)，以獲得包含E83V和D92N雙突變酶基因的重組質粒。

3.根據權利要求2所述的方法，其中，步驟2)中的PCR條件為：98℃預變性5min；98℃變性10s；55℃退火15s；72℃延伸6min，25個循環，72℃延伸6min。

4.一種用于制備碳酸二甲酯的基因工程菌，所述基因工程菌包含如權利要求1所述的重組質粒。

5.根據權利要求4所述的基因工程菌，其中，所述基因工程菌為以大腸桿菌為出發菌株，并包含表達脂肪酶突變體的質粒，

其中，所述脂肪酶突變體相對于擴展青霉PF898的脂肪酶具有選自以下突變中的任一者或兩者組合的突變：第83位谷氨酸突變為纈氨酸(E83V)，以及第92位天冬氨酸突變為天冬酰胺(D92N)。

6.一種脂肪酶突變體，所述脂肪酶突變體包含選自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10的氨基酸序列。

7.一種制備碳酸二甲酯的方法，所述方法包括利用權利要求4所述的基因工程菌進行液體發酵生產脂肪酶突變體以催化制備碳酸二甲酯的步驟。

8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述方法包括以下步驟：

1)將所述基因工程菌種子液按照接種量為培養基體積的1.6％接種于培養基，然后加入誘導劑IPTG至終濃度0.2mmol/L，培養后，收集菌體；

2)將步驟1)得到的菌體用M9培養基重懸獲得菌液；以及

3)將底物甲醇與碳酸丙烯酯/碳酸乙烯酯加入到步驟2)重懸的菌液中進行反應。

9.根據權利要求8所述的方法，其中，在步驟3)中，按照摩爾比16:1的比例加入底物甲醇與碳酸丙烯酯/碳酸乙烯酯。