[發(fā)明專利]一種重組質(zhì)粒、包含其的基因工程菌及其在制備碳酸二甲酯中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110220540.0
• 申請日: 2021-02-26
• 公開（公告）號: CN112961871A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹斌;牟新東;石健;劉濤;王文久
• 申請（專利權(quán)）人: 源創(chuàng)核新（北京）新材料科技有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/20;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 北京金信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 李雪芹;張皓

本申請涉及一種重組質(zhì)粒、包含其的基因工程菌及其在制備碳酸二甲酯中的應(yīng)用。本申請的基因工程菌可以表達包含E83V、D92N或兩者的突變的脂肪酶突變體，在催化甲醇與碳酸丙烯酯或碳酸乙烯酯進行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備碳酸二甲酯中，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化率高、選擇性高、普適性高的特點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種重組質(zhì)粒、由其表達的脂肪酶突變體及其在制備碳酸二甲酯中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

碳酸二甲酯簡稱DMC，常溫時是一種無色透明、略有氣味的液體，熔點4℃，沸點90.1℃，密度1.0699/cm³，難溶于水，但可以與醇、醚、酮等幾所有的有溶劑混溶。碳酸二甲酯性能優(yōu)良，用途廣泛，除用于甲基化、羰基化和碳基甲氧基化反應(yīng)外，從DMC出發(fā)還可制備多種衍生物，如高性能的樹脂、溶劑、染料中間體、藥物、香料、潤滑油添加劑等。碳酸二甲酯具有無毒、對環(huán)境影響小的特性，屬于新型的“綠色”化工原料，被稱為21世紀有機合成的“新基石”，并在近年來取得了迅猛的發(fā)展。

DMC現(xiàn)有幾種生產(chǎn)工藝，存在以下缺陷：光氣法污染嚴重，劇毒物的使用不符合綠色化工要求，已經(jīng)被淘汰；氧化羰基化法反應(yīng)條件苛刻，設(shè)備投資較大，工藝操作費用高，CO的引入有潛在爆炸危險；酯交換法單程轉(zhuǎn)化率低，需大回流比提高反應(yīng)物轉(zhuǎn)化率，能耗高，另外，副產(chǎn)物二元醇受到市場條件限制，影響經(jīng)濟效益。

酶作為一種生物催化劑，近年來已被人們廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)與檢測、環(huán)保技術(shù)、生物技術(shù)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前研究和應(yīng)用最廣泛的脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一類能催化油脂和短鏈醇進行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成脂肪酸甲酯的生物催化劑，脂肪酶所介導(dǎo)的反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、醇用量小、產(chǎn)品易收集純化、無污染物排放等優(yōu)點。目前國內(nèi)外用于轉(zhuǎn)酯化研究的脂肪酶主要為諾維信公司生產(chǎn)的Novozym435，此酶為樹脂固定化酶，載體為大孔丙烯酸樹脂，價格高昂，不利于酶法制備化工原料的工業(yè)化生產(chǎn)。雖然已有專利報道使用脂肪酶催化甲醇與碳酸乙烯酯或甲醇與碳酸丙烯酯進行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備碳酸二甲酯，但反應(yīng)時間較長，酶活性有待提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可高效催化制備碳酸二甲酯的基因工程菌，本發(fā)明提供的基因工程菌可以表達突變脂肪酶，從而有效提高制備碳酸二甲酯的效率，應(yīng)用前景廣闊。

一方面，本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，其在酶切位點EcoRI和HindIII之間包含用于表達脂肪酶突變體的核苷酸序列，其中所述序列選自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：9。

另一方面，本發(fā)明提供一種上述重組質(zhì)粒的制備方法，所述方法包括：

1)將PEL編號為GenBank:AF284064.1的基因序列通過全基因合成，并連接在質(zhì)粒pET-28a上，酶切位點為EcoRI和HindIII，獲得質(zhì)粒pET28a-PEL；

2)以質(zhì)粒pET28a-PEL為模板，以下列引物對之一進行高保真PCR擴增：

引物對1：

83正向:5’GCTCTCATCACTCCTGTGCTCTCGGGCGTGACT 3’(SEQ ID NO：1)

83反向:5’AGTCACGCCCGAGAGCACAGGAGTGATGAGAGC 3’(SEQ ID NO：2)；

引物對2：

92正向:5’ACTTTCCCCTCTAATGTGAAGATCATG 3’(SEQ ID NO：5)

92正向:5’CATGATCTTCACATTAGAGGGGAAAGT 3’(SEQ ID NO：6)；

3)PCR之后通過瓊脂糖電泳驗證PCR產(chǎn)物大小，異丙醇沉淀回收PCR產(chǎn)物，DpnI酶切去除模板，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取得到包含E83V或D92N突變酶基因的重組質(zhì)粒，