[發明專利]一種山羊支原體肺炎二聯滅活疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 202110218977.0
• 申請日: 2021-02-26
• 公開（公告）號: CN112972667A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 陶立;李常挺;吳翠蘭;彭昊;馬春霞;蘭美益;鐘舒紅;李軍
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61K39/39;A61P31/04;C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 盧穎

1.一種山羊支原體肺炎二聯滅活疫苗，其特征在于：含有綿羊肺炎支原體(MO)、絲狀支原體山羊亞種(MMC)以及蜂膠佐劑；

所述的菌種從發病山羊肺組織分離取得，用于制備疫苗的菌種嚴格控制在其分離取得后傳8代以內的代次，在培養基中生長活菌的滴度達1×10⁹CCU/mL。

2.根據權利要求1所述的山羊支原體肺炎二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)按照培養基量4％的比例分別將綿羊肺炎支原體(MO)和絲狀支原體山羊亞種(MMC)接種于各自的支原體培養基中，于37℃搖床培養5天，至菌液生長滴度達到1×10⁷～1×10⁹CCU/mL，得到初始制苗菌液；取初始制苗菌液于12000r/min下離心3min，棄上清液，沉淀用滅菌生理鹽水溶解，最終使綿羊肺炎支原體(MO)和絲狀支原體山羊亞種(MMC)的菌濃度均為4×10⁹CCU/mL，得到綿羊肺炎支原體(MO)和絲狀支原體山羊亞種(MMC)制苗菌液；

(2)在綿羊肺炎支原體(MO)和絲狀支原體山羊亞種(MMC)制苗菌液中分別加入甲醛溶液，使甲醛溶液的終濃度均為0.15％；充分混勻，在37℃下滅活24～48h，期間搖瓶4～5次，得到滅活的綿羊肺炎支原體(MO)和絲狀支原體山羊亞種(MMC)菌液；將滅活后的綿羊肺炎支原體(MO)和絲狀支原體山羊亞種(MMC)制苗菌液接種于支原體培養基中，于37℃下培養5～7d，支原體培養基均無被接種支原體和其他微生物生長即判為滅活完全；

(3)在無菌操作下，取滅活的綿羊肺炎支原體(MO)和絲狀支原體山羊亞種(MMC)菌液按照1:1混合，得到混合菌液，再于混合菌液中加入蜂膠佐劑，使蜂膠佐劑在混合菌液中的最終含量為10～15mg/mL，充分搖勻，獲得山羊支原體肺炎二聯滅活疫苗。

3.根據權利要求2所述的山羊支原體肺炎二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于：所述的支原體培養基主要由豬肺消化湯、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鮮酵母浸出液組成，按以下步驟制備：

(1)胰腺提取液的制備

取經檢疫合格豬的新鮮胰臟，去除脂肪組織，切碎；500g胰臟加入1500mL ddH₂O和500mL無水乙醇，室溫下每隔2～4h振蕩一次，72h后用濾紙過濾即得；

(2)豬肺消化湯的制備

取經檢疫合格豬的新鮮豬肺，去除氣管和淋巴結締組織，切碎，1500g豬肺加入2000mLddH₂O，攪拌加熱至80℃，再加入質量濃度0.8％的無水NaHCO₃ 2500mL，混勻后冷至45℃，加入胰腺提取液500mL、氯仿50mL，混勻置37℃下6～7h，之后加濃硫酸40mL，100℃蒸汽加熱1h，紗布過濾，用1moL/L NaOH溶液調pH至8.0，100℃蒸汽加熱1h，趁熱濾紙過濾，調節pH值至7.6，121℃高壓滅菌20min，冷卻即得；

(3)1％水解乳蛋白胨Earle液的制備

配制原液甲：NaCl 20.0g，KCl 4.0g，NaH₂PO₄·2H₂O 1.4g，葡萄糖20.0g，將以上各成分溶解于500mL水中，即得；配制原液乙：NaCl 2.0g，MgCl₂·6H₂O 1.7g，0.4％酚紅液50mL，將以上各成分溶解于500mL水中，即得；配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均勻即得；將水解乳蛋白胨和Earle液按質量體積比1:100混合完全溶解，裝瓶，115℃高壓滅菌20min，冷卻即得；

(4)25％新鮮酵母浸出液的制備

將250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH₂O中，浸泡1h后加熱至沸騰、冷卻，3000r/min離心20min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液調節pH至8.0，濾紙初濾后，0.22μL濾膜過濾除菌，即得；

將步驟(2)至(4)獲得的豬肺消化湯、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鮮酵母浸出液按體積百分數48％、50％、2％在無菌條件下混合，即得支原體培養基。

4.根據權利要求2所述的山羊支原體肺炎二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的蜂膠佐劑的制備方法如下：稱取一定質量的蜂膠，讓其充分溶于體積濃度為95％的乙醇中，過濾得到不能溶解的雜質，濾液為蜂膠佐劑。