[發明專利]蛋白質的選擇性還原

在審

• 申請號: 202110215052.0
• 申請日: 2015-02-11
• 公開（公告）號: CN112979786A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: D·L·梅亞
• 申請（專利權）人: 西雅圖基因公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K1/34;C07K1/113;C07K1/08;A61K47/68
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 高一平;徐迅

本發明提供一種制備脫封端的半胱氨酸蛋白質制劑的方法，包括脫封端的工程化的半胱氨酸抗體制劑。所述方法包括，其中，將還原試劑與工程化的半胱氨酸抗體分子接觸，每個抗體分子具有至少一個封端的工程化的半胱氨酸殘基和至少一個鏈間二硫鍵，以及將還原試劑與抗體分子在足以脫封端工程化的半胱氨酸殘基并形成封端副產物的條件下反應。所述方法還包括在還原反應過程中移除封端副產物。基本上所有還原前存在于抗體分子中的鏈間二硫鍵在還原反應后被保留。還描述了抗體偶聯物以及采用脫封端的抗體制劑來制備抗體偶聯物的方法。

本申請是2015年2月11日提交的發明名稱為“蛋白質的選擇性還原”的申請號為2015800083064的中國發明專利申請的分案申請。

相關申請的交叉引用

本申請要求2014年2月11日提交的美國專利申請號61/938,378的優先權，其內容通過引用全文納入本文。

發明背景

選定的氨基酸被突變成半胱氨酸Cys的單克隆抗體(例如工程化的半胱氨酸mAbs，即ecmAbs)特別適合用于偶聯物(例如抗體藥物偶聯物(ADCs))，因為這些由其衍生的偶聯物具有有利的特性，其中包括同質性、有利的藥物動力學、穩定性和溶解性。這些半胱氨酸突變被置于在抗體氨基酸序列中的某些位置，這些位置通常不會形成鏈間或者鏈內的二硫鍵，并且在細胞內產生突變mAb的表達機制會將半胱氨酸殘基作為未配對的半胱氨酸進行處理。因此，工程化半胱氨酸，通常會用非編碼的半胱氨酸分子以混合的二硫鍵產物形式表達(例如，工程化半胱氨酸通常用封端劑(例如半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸、谷胱甘肽)進行“封端(capped)”)。

因此，為了從ecmAbs出發制備偶聯物(例如ADC)，通常需要將ecmAb置于還原條件下，從而將工程化半胱氨酸從混合的二硫鍵產物轉化為自由巰基，通常這一“脫封端”或者“活化”伴隨著ecmAb鏈間二硫鍵的還原。盡管鏈間二硫鍵可以通過溫和氧化重新形成，但是這種再氧化步驟增加了ADC制備過程中復雜性和費用。選擇性還原方法是難以實現的，因為已證明難以還原工程化半胱氨酸殘基的同時而不還原鏈間二硫鍵。因此，需要開發用于對工程化半胱氨酸殘基的進行脫封端的選擇性還原方法。本發明解決了這個和其它需求。

發明概述

在本發明中，提供了一種選擇性還原工程化的半胱氨酸抗體的方法。這種方法包括：將一還原劑與工程化的半胱氨酸抗體分子接觸，每個抗體分子含有至少一個封端的工程化的半胱氨酸殘基和至少一個鏈間二硫鍵，以及將還原劑與抗體分子在足以使工程化的半胱氨酸殘基“脫封端”并且形成封端副產物的條件下進行反應。封端副產物在還原反應的過程中被移去。這種方法導致形成脫封端的工程化半胱氨酸抗體制劑。這種脫封端的工程化半胱氨酸抗體制劑可以包含封端的和脫封端的工程化半胱氨酸抗體。還原反應前存在于抗體分子中基本上所有的鏈間二硫鍵，在脫封端的工程化半胱氨酸抗體制劑中仍然保留。所述方法可以進一步包括以下步驟：在移除封端副產物時，向還原反應補充額外的還原劑。在還原反應過程中從反應混合物中移除封端副產物，可以通過例如透析或滲濾進行。在優選的實施方式中，在還原反應混合物中，封端副產物濃度被維持低于如下濃度：在該濃度下，再封端阻止了工程化半胱氨酸殘基被進一步活化。

在某些方面，所述方法提供一種非封端的工程化半胱氨酸抗體制劑。典型地，在抗體制劑中至少60％的工程化的半胱氨酸是非封端工程化的半胱氨酸殘基。在某些方面，在抗體制劑中至少70％，至少75％或者至少80％的工程化的半胱氨酸殘基是非封端工程化的半胱氨酸殘基。在某些方面，采用本發明方法，在抗體分子中至少85％的還原反應前就存在的鏈間二硫鍵在脫封端工程化的半胱氨酸抗體制劑中仍然保留。在某些方面，選擇還原劑和還原條件，使得不超過20％，不超過15％，不超過10％或者不超過5％的抗體分子中存在的鏈間二硫鍵，在還原反應過程中被轉化成一對自由巰基。

在相關方面，這個發明提供抗體偶聯物，包括抗體藥物偶聯物，和采用脫封端抗體制備抗體偶聯物的方法。在制備抗體藥物偶聯物之前，抗體制劑中殘留的還原劑被移除。