本發明屬于生物工程領域，具體涉及用于高效外源蛋白表達和高密度培養的基因工程枯草芽孢桿菌。通過對組氨酸缺陷型枯草芽孢桿菌進行遺傳改造，通過基因操作恢復其hisC基因的功能，以獲得非營養缺陷型菌株。進一步地，通過敲除基因spoIIAC和srfAC，獲得的菌株更適于用于表達多種異源蛋白。本發明獲得的用于表達異源蛋白的非營養缺陷型枯草芽孢桿菌，可提供一種低成本高密度發酵技術，能夠大幅降低發酵成本，并高水平表達異源蛋白。
技術領域
本發明屬于生物工程領域，具體涉及用于高效外源蛋白表達和高密度培養的基因工程枯草芽孢桿菌。
背景技術
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）廣泛應用于工業酶制劑的生產和代謝產物的合成，具有以下優點：第一，它具備安全的表達系統。B. subtilis是國際公認的安全微生物（GRAS），可用于食品的生產，沒有大腸桿菌（Escherichia coli）等革蘭氏陰性細菌產生的內毒素，也不會產生引起人類和哺乳動物發熱的熱源性脂多糖（LPS）和致熱致敏性蛋白質。第二，繁殖迅速，培養周期短，發酵技術相對成熟。第三，B. Subtilis具有多種蛋白分泌途徑，本身能分泌多種蛋白酶和淀粉酶，且只有單層的細胞膜，胞內蛋白不易形成包涵體。第四，遺傳背景清晰，超過70種枯草芽孢桿菌完成全基因組測序，基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和分子生物學等領域的研究也得到迅速發展；存在一批豐富的質粒表達系統、基因組編輯工具和基因表達調控工具。第五，密碼子沒有明顯的偏愛性。
B. subtilis 168及其衍生體，由于其生長特性好且性質穩定，是實驗室研究和工業化生產最常用的枯草芽孢桿菌宿主。由于B. subtilis168生長到穩定期后會向胞外分泌大量蛋白酶，容易造成目標蛋白的降解和產量的下降，前期科研人員對其蛋白酶基因進行了改造，獲得了一系列蛋白酶缺陷菌株。例如，1984年，Kawamura等人通過對B. subtilis 168進行改造，構建了中性蛋白酶基因（nprE）和堿性蛋白酶基因（aprE）的失活菌株B. subtilis DB104，胞外蛋白酶酶活B. subtilis 168減少96%以上（ Kawamura F , Doi R H. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient inextracellular alkaline and neutral proteases.[J]. Journal of Bacteriology,1984, 160(1):442-4.）。1989年，Wang等人在B. subtilis DB104菌株基礎上敲除失活絲氨酸蛋白酶基因（epr），胞外蛋白酶酶活降至B. subtilis 168的1%以下。隨后，還有研究構建了缺失了六個胞外蛋白酶的菌株B. subtilis WB600、七個胞外蛋白酶基因的菌株B. subtilis WB700和缺失了八個胞外蛋白酶的菌株B. subtilis WB800，使胞外蛋白酶水解能力降低至B. subtilis 168的0.32%以下（Wu X C , Lee W , Tran L , et al.Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a straindeficient in six extracellular proteases.[J]. Journal of Bacteriology, 1991,173(16):4952-4958.）。這些對蛋白酶的敲除改造有利于提高枯草芽孢桿菌對異源蛋白的表達效率。
