[發(fā)明專利]用于高效外源蛋白表達(dá)和高密度培養(yǎng)的工程枯草芽孢桿菌

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110208427.0
• 申請(qǐng)日: 2021-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN112592881A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬延和;石婷;李運(yùn)杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/54;C12N9/10;C12N15/75;C12R1/125
• 代理公司: 北京商專永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽(yáng)石文

1.一種用于高效外源蛋白表達(dá)和高密度培養(yǎng)的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于：通過(guò)基因工程方法在組氨酸缺陷型枯草芽孢桿菌胞內(nèi)表達(dá)由hisC基因編碼的組氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶；其中，所述枯草芽孢桿菌選自：組氨酸缺陷型菌株SCK6，其芽孢桿菌遺傳保藏中心（Bacillus Genetic Stock Center，BGSC）的保藏編號(hào)為1A976；所述hisC基因編碼的氨基酸序列如NCBI-Protein ID：NP_390143所示。

2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述基因工程方法是通過(guò)在所述枯草芽孢桿菌導(dǎo)入游離質(zhì)粒表達(dá)，和/或在其基因組上原位突變，和/或在其基因組上引入單個(gè)或多個(gè)拷貝的具有功能的hisC基因。

3.如權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其特征在于，進(jìn)一步對(duì)所述枯草芽孢桿菌中的基因spoIIAC和/或srfAC進(jìn)行失活、敲除、或者降低其表達(dá)。

4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，構(gòu)建所述重組枯草芽孢桿菌時(shí)首先失活、敲除其基因upp以獲得能夠進(jìn)行高效無(wú)痕遺傳操作的復(fù)篩選標(biāo)記。

5.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法獲得的重組枯草芽孢桿菌。

6.如權(quán)利要求5所述的重組枯草芽孢桿菌在表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。

7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述外源基因編碼的是葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，塔格糖6-磷酸4-差向異構(gòu)酶，塔格糖6-磷酸磷酸酶，磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖異構(gòu)酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，異淀粉酶，葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖激酶，α-淀粉酶，葡萄糖異構(gòu)酶，L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向異構(gòu)酶，D-阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶中的一種或多種，通過(guò)基因工程方法將所述外源基因?qū)胨鲋亟M枯草芽孢桿菌中。

8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于，其是通過(guò)發(fā)酵所述重組枯草芽孢桿菌以表達(dá)所述外源基因，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基中采用無(wú)機(jī)氮源。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有如下組分：酵母抽提物、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸二氫鉀、微量元素、氯化鈣，維生素B1，氯化銨和葡萄糖。

10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：酵母抽提物0.1-10 g/L、硫酸鎂0.1-10 g/L、硫酸錳0.1-10 g/L、磷酸二氫鉀0.1-10 g/L、微量元素0.1-10 mL/L、氯化鈣0.1-10 g/L，維生素B1 0.1-10 g/L，氯化銨0.1-50 g/L和葡萄糖0.1-50g/L。

11.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵的過(guò)程中采用磷酸或檸檬酸和氨水控制pH為5.0-8.5，發(fā)酵溫度為18℃-45℃。

12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵過(guò)程中采用磷酸或檸檬酸和氨水控制pH為7.0，發(fā)酵溫度為37℃。