[發(fā)明專利]一種自體MSCs體內(nèi)胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110206410.1
• 申請(qǐng)日: 2021-02-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113101302A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小龍;孫前明;趙凱;楊勝超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省銀豐生物工程技術(shù)有限公司;銀豐生物工程集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): A61K35/28
• 分類號(hào): A61K35/28;A61P3/10
• 代理公司: 南京君陶專利商標(biāo)代理有限公司 32215
• 代理人: 嚴(yán)海晨

本發(fā)明公開(kāi)了一種自體MSCs體內(nèi)胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，包括人MSCs體外誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞團(tuán)、雙硫腙染色、大鼠糖尿病模型的制備、胰島樣細(xì)胞團(tuán)的移植、胰腺組織免疫組化檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析。本發(fā)明的有益效果是：本研究使我們認(rèn)識(shí)到自體MSCs在經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化后，可以轉(zhuǎn)化成為胰島樣細(xì)胞團(tuán)，胰島樣細(xì)胞團(tuán)在移植后具有一定的胰島素分泌功能，能達(dá)到治療糖尿病的目的。這些都為間充質(zhì)干細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床上糖尿病的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并有望使其成為一種更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的治療的手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種自體MSCs體內(nèi)胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，具體為一種自體MSCs體內(nèi)胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，屬于糖尿病研究技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

糖尿病的病程長(zhǎng)，藥物依賴性強(qiáng)，并且會(huì)引發(fā)多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，是亟待解決的一大難題，糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的代謝性疾病，目前已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大疾病。雖然糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚，但胰島β細(xì)胞功能進(jìn)行性衰竭是目前公認(rèn)的發(fā)病重要環(huán)節(jié)和決定因素。因此，替代和恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能成為治療糖尿病的必然選擇，近年來(lái)，雖然胰島素的劑型和給藥途徑有了顯著進(jìn)展，但臨床實(shí)踐證明，外源性胰島素治療不能像自身分泌胰島素那樣精確的控制血糖，且糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變等慢性并發(fā)癥卻逐漸成為糖尿病患者致死、致殘的主要原因。因此，胰島細(xì)胞移植又逐漸成為研究者的關(guān)注點(diǎn)。

查閱文獻(xiàn)資料得知，干細(xì)胞研究的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展，通過(guò)自體移植同時(shí)避免了供體缺乏和免疫排斥兩大難題，并且有報(bào)道顯示，體外實(shí)驗(yàn)中胰島細(xì)胞的移植能夠有效降低血糖和減少并發(fā)癥的發(fā)生，MSCs體外向胰島樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，及其移植后對(duì)糖尿病大鼠的治療效果，為臨床上糖尿病的治療提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就在于為了解決問(wèn)題而提供一種自體MSCs體內(nèi)胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的：一種自體MSCs體內(nèi)胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，包括以下步驟：

步驟一、人MSCs體外誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞團(tuán)，取傳代至第3代的人MSCs，待細(xì)胞融合至70%-80%后，換用含10ug/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、尼克酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化；

步驟二、雙硫腙染色，取雙硫腙粉末10mg溶于1mL二甲基亞砜中，配成儲(chǔ)備液，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟三、大鼠糖尿病模型的制備，包括以下過(guò)程：

（1）、將0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH4.5）將鏈脲佐菌素制成2%注射液，待大鼠空腹12h后，經(jīng)腹腔注射70mg/Kg鏈脲佐菌素和0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液；

（2）、大鼠分別于注射前、注射后48h、5d、8d空腹斷尾采血，測(cè)定全血血糖濃度；

（3）、大鼠血糖濃度正常值為2.80-7.56mmol/L，選用連續(xù)2次血糖濃度高于16.7mmol/L的大鼠作為糖尿病模型。

步驟四、胰島樣細(xì)胞團(tuán)的移植，造模后，胰島樣細(xì)胞組大鼠于腎被膜下移植入胰島樣細(xì)胞2*106個(gè)，間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠于腎被膜下移植入未誘導(dǎo)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞2*106個(gè)，模型對(duì)照組大鼠于腎被膜下移植不含任何細(xì)胞的培養(yǎng)液1mL，各組大鼠均于移植前及移植后48h測(cè)定空腹血糖濃度，之后每周定點(diǎn)測(cè)空腹血糖及體質(zhì)量1次；

步驟五、胰腺組織免疫組化檢測(cè)，胰腺取出后，迅速放入甲醛溶液中，固定3h后常規(guī)免疫組化法染色，酶修復(fù)30min，加羊抗鼠一抗過(guò)夜，次日二康修復(fù)；

步驟六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟一中，誘導(dǎo)前，MSCs呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)。誘導(dǎo)4d后，細(xì)胞向中央聚集，同時(shí)出現(xiàn)胰島樣細(xì)胞團(tuán)。誘導(dǎo)7d的胰島樣細(xì)胞團(tuán)經(jīng)雙硫腙染色15min后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)多數(shù)細(xì)胞著色，呈現(xiàn)棕紅色陽(yáng)性表達(dá)，周邊有少數(shù)細(xì)胞不著色。