[發明專利]一種自體MSCs體內胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法

在審

• 申請號: 202110206410.1
• 申請日: 2021-02-24
• 公開（公告）號: CN113101302A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 王小龍;孫前明;趙凱;楊勝超
• 申請（專利權）人: 河南省銀豐生物工程技術有限公司;銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61P3/10
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 嚴海晨

1.一種自體MSCs體內胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、人MSCs體外誘導為胰島樣細胞團，取傳代至第3代的人MSCs，待細胞融合至70%-80%后，換用含10ug/L堿性成纖維細胞生長因子、尼克酰胺的DMEM高糖培養基進行誘導分化；

步驟二、雙硫腙染色，取雙硫腙粉末10mg溶于1mL二甲基亞砜中，配成儲備液，-20℃保存備用；

步驟三、大鼠糖尿病模型的制備，包括以下過程：

（1）、將0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液將鏈脲佐菌素制成2%注射液，待大鼠空腹12h后，經腹腔注射70mg/Kg鏈脲佐菌素和0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液；

（2）、大鼠分別于注射前、注射后48h、5d、8d空腹斷尾采血，測定全血血糖濃度；

（3）、大鼠血糖濃度正常值為2.80-7.56mmol/L，選用連續2次血糖濃度高于16.7mmol/L的大鼠作為糖尿病模型。

步驟四、胰島樣細胞團的移植，造模后，胰島樣細胞組大鼠于腎被膜下移植入胰島樣細胞2*106個，間充質干細胞組大鼠于腎被膜下移植入未誘導的臍帶間充質干細胞2*106個，模型對照組大鼠于腎被膜下移植不含任何細胞的培養液1mL，各組大鼠均于移植前及移植后48h測定空腹血糖濃度，之后每周定點測空腹血糖及體質量1次；

步驟五、胰腺組織免疫組化檢測，胰腺取出后，迅速放入甲醛溶液中，固定3h后常規免疫組化法染色，酶修復30min，加羊抗鼠一抗過夜，次日二康修復；

步驟六、統計學方法分析。

2.根據權利要求1所述的一種自體MSCs體內胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步驟一中，誘導前，MSCs呈長梭形，貼壁生長。誘導4d后，細胞向中央聚集，同時出現胰島樣細胞團。誘導7d的胰島樣細胞團經雙硫腙染色15min后，倒置顯微鏡下可見細胞團多數細胞著色，呈現棕紅色陽性表達，周邊有少數細胞不著色。

3.根據權利要求1所述的一種自體MSCs體內胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步驟二中，雙硫腙臨用時用PBS緩沖液1：100稀釋，0.22μm孔徑濾膜過濾。于倒置顯微鏡下加入到隨機挑選的誘導后的胰島樣細胞團，置37℃孵育箱中孵育15min，PBS洗3次，鏡檢。

4.根據權利要求1所述的一種自體MSCs體內胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步驟三中，造模前各組大鼠空腹血糖濃度均處于正常范圍內。腹腔注射鏈脲菌素48h后，大鼠血糖濃度迅速升高。注射后第5天和第8天，大鼠血糖濃度均大于16.7mmol/L，證明建模成功。

5.根據權利要求1所述的一種自體MSCs體內胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步驟四中，胰島團細胞移植后2周，胰島樣細胞組大鼠血糖濃度明顯降低，且胰島素分泌增加，一直維持至第6周。間充質干細胞組大鼠血糖濃度在移植后有所下降，胰島素分泌有所增加，至移植后第4周胰島素分泌減少，之后維持較低水平。正常對照組一直處于糖尿病血糖狀態，且無胰島素分泌。

6.根據權利要求1所述的一種自體MSCs體內胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步驟五中，在進行胰腺組織免疫組化檢測時，利用蘇木精復染，SABC試劑盒顯色。

7.根據權利要求1所述的一種自體MSCs體內胰島歸巢分化治療糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步驟六中，采用SPSS軟件進行統計學分析。