[發(fā)明專利]一種肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒及制備使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110203778.2
• 申請日: 2021-02-23
• 公開（公告）號: CN113092757A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉鐳;鈕淋;許倩;郭娜;李琳;徐穎;李祥伶
• 申請（專利權(quán)）人: 承德醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/574;G01N33/58;G01N33/545;G01N33/53
• 代理公司: 天津垠坤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12248
• 代理人: 于德江

本發(fā)明提供了一種肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒及制備使用方法，涉及醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域，包括：抗體預(yù)包被酶標(biāo)板、ELA2?DNA標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、Anti?DNA?POD抗體、ABTS溶液、ABTS終止溶液和洗滌液，其中，抗體預(yù)包被酶標(biāo)板由純化抗人ELA2抗體包被制成；ELA2?DNA標(biāo)準(zhǔn)品中含有多個肺癌肝轉(zhuǎn)移患者血清；樣品稀釋液包括磷酸鹽緩沖液和調(diào)節(jié)酸堿度的鹽酸；洗滌液為PBST溶液。通過采集肺癌患者外周血標(biāo)本，特異性檢測血清中NETs成分蛋白彈性蛋白酶(ELA2)?DNA含量，篩查患者是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，組分簡單、易操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域，具體而言，涉及一種肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒及制備使用方法。

背景技術(shù)

肺癌是一種發(fā)病率高、惡性程度高、預(yù)后差的惡性疾病，大部分患者被診斷患有肺癌時，往往已經(jīng)到晚期，癌細(xì)胞發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這也是導(dǎo)致肺癌死亡率高的主要原因。肝臟是肺癌常見的轉(zhuǎn)移部位，約有30％的肺癌患者會出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，且臨床上肝轉(zhuǎn)移早期常呈隱匿經(jīng)過，檢出肝轉(zhuǎn)移對正確分期、制訂合理治療方案和判斷預(yù)后具有重要意義。因此，建立一個準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法，監(jiān)測肺癌肝轉(zhuǎn)移是亟待解決的問題。

目前診斷肺癌患者是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的手段主要有超聲、CT及MRI等影像學(xué)檢查，但由于轉(zhuǎn)移瘤病灶分布及大小等，在臨床工作中易被誤診、漏診。另外，肝穿刺活檢也可明確診斷肝轉(zhuǎn)移瘤和尋找原發(fā)癌，但這種有創(chuàng)操作有引起腹腔內(nèi)出血的可能。因此目前缺少一種準(zhǔn)確、靈敏的診斷肺癌肝轉(zhuǎn)移的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)或相關(guān)技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一，公開了一種肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒及制備使用方法，基于中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的理論基礎(chǔ)，建立一種操作簡便、特異性高的無創(chuàng)檢測方法(試劑診斷)，通過采集肺癌患者外周血標(biāo)本，檢測血清中彈性蛋白酶(ELA2)-DNA水平，篩查患者是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的第一方面公開了一種肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒，包括：抗體預(yù)包被酶標(biāo)板、ELA2-DNA標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、Anti-DNA-POD抗體、ABTS溶液、ABTS終止溶液和洗滌液，其中，抗體預(yù)包被酶標(biāo)板由純化抗人ELA2抗體包被制成；ELA2-DNA標(biāo)準(zhǔn)品中含有多個肺癌肝轉(zhuǎn)移患者混合血清；樣品稀釋液包括磷酸鹽緩沖液和調(diào)節(jié)酸堿度的鹽酸；洗滌液為PBST溶液。

根據(jù)本發(fā)明公開的肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒，優(yōu)選地，樣品稀釋液具體包括：NaCl、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄、HCl和雙蒸水。

根據(jù)本發(fā)明公開的肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒，優(yōu)選地，ABTS溶液具體包括：ABTS二胺鹽溶液和二硫酸鉀溶液；ABTS終止溶液具體包括：十二烷基硫酸鈉和去離子水；PBST溶液為含0.05％Tween20的1×磷酸鹽緩沖液。

根據(jù)本發(fā)明公開的肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒，優(yōu)選地，預(yù)包被酶標(biāo)板為96孔聚苯乙烯透明微孔板。

本發(fā)明的第二方面公開了一種肺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒的制備方法，包括：純化抗人ELA2抗體用0.01mol/L pH 9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋成5μg/ml，按每孔100μl的量包被ELISA微孔板，4℃過夜；

包被步驟完成后，去除ELISA微孔板內(nèi)的包被液，按每孔160μl的量加入1％BSA封閉液，4℃封閉過夜；

封閉步驟完成后，去除ELISA微孔板內(nèi)的封閉液后制成抗體預(yù)包被酶標(biāo)板；

收集肺癌肝轉(zhuǎn)移患者血液樣本，在4℃溫度條件下以3000rmp的速率離心10min，取上清，制成血清樣本；

將血清樣本進(jìn)行5倍稀釋，制成稀釋樣本；

清洗預(yù)包被酶標(biāo)板，每孔加入100μl稀釋樣本，設(shè)置陰性孔，封板后在25℃溫度條件下，以250rmp的速率震蕩，孵育120min；