[發明專利]一種肺癌肝轉移早期診斷試劑盒及制備使用方法

在審

• 申請號: 202110203778.2
• 申請日: 2021-02-23
• 公開（公告）號: CN113092757A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 劉鐳;鈕淋;許倩;郭娜;李琳;徐穎;李祥伶
• 申請（專利權）人: 承德醫學院
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/574;G01N33/58;G01N33/545;G01N33/53
• 代理公司: 天津垠坤知識產權代理有限公司 12248
• 代理人: 于德江

1.一種肺癌肝轉移早期診斷試劑盒，其特征在于，包括：抗體預包被酶標板、ELA2-DNA標準品、樣品稀釋液、Anti-DNA-POD抗體、ABTS溶液、ABTS終止溶液和洗滌液，其中，所述抗體預包被酶標板由純化抗人ELA2抗體包被制成；所述ELA2-DNA標準品是多個肺癌肝轉移患者的混合血清；所述樣品稀釋液包括磷酸鹽緩沖液和調節酸堿度的鹽酸；所述洗滌液為PBST溶液。

2.根據權利要求1所述的肺癌肝轉移早期診斷試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液具體包括：NaC1、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄、HCl和雙蒸水。

3.根據權利要求1所述的肺癌肝轉移早期診斷試劑盒，其特征在于，所述ABTS溶液具體包括：ABTS二胺鹽溶液和二硫酸鉀溶液；所述ABTS終止溶液具體包括：十二烷基硫酸鈉和去離子水；所述PBST溶液為含0.05％Tween20的1×磷酸鹽緩沖液。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的肺癌肝轉移早期診斷試劑盒，其特征在于，所述預包被酶標板為96孔聚苯乙烯透明微孔板。

5.一種肺癌肝轉移早期診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，包括：

純化抗人ELA2抗體用0.01mol/L pH 9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋成5μg/ml，按每孔100μl的量包被ELISA微孔板，4℃過夜；

包被步驟完成后，去除ELISA微孔板內的包被液，按每孔160μl的量加入1％BSA封閉液，4℃封閉過夜；

封閉步驟完成后，去除所述ELISA微孔板內的封閉液后制成抗體預包被酶標板；

收集肺癌肝轉移患者血液樣本，在4℃溫度條件下以3000rmp的速率離心10min，取上清，制成血清樣本；

將所述血清樣本進行5倍稀釋，制成稀釋樣本；

清洗所述預包被酶標板，每孔加入100μl所述稀釋樣本，設置陰性孔，封板后在25℃溫度條件下，以250rmp的速率震蕩，孵育120min；

孵育完成后洗板并拍干；

將Anti-DNA-POD抗體用樣品稀釋液20倍稀釋，加入反應孔，每孔100μl，封板后在25℃溫度條件下，以300rmp的速率震蕩，孵育120min；

反應完成后洗板并拍干；

每孔加入100μlABTS溶液，設置空白孔，封板后在25℃溫度條件下，以250rmp的速率震蕩，孵育20～30min；

待顯色均勻，在每孔加入100μl ABTS終止溶液終止反應，并于405nm處測定OD值；

根據ELA2-DNA含量數值，將多個肺癌肝轉移患者的血清混合；

另取一酶標板，將純化的1μg/ml的小牛胸腺DNA作為檢測混合血清樣本中游離DNA的標準品，使用TE緩沖液稀釋1μg/ml小牛胸腺DNA，調整體積為50μl加入酶標板，再向每孔加入50μl的2×PicaGreen試劑，使終體系為100μl；

使用TE緩沖液將混合的血清樣本分別做0倍稀釋、5倍稀釋、25倍稀釋，向酶標板中每孔加入50μl的混合血清樣本，再向每孔加入50μl的2×PicaGreen試劑，使終體系為100μl；

避光于室溫下放置2min～5min，使用多功能酶標儀選擇藍色激發光，檢測樣品中游離DNA含量；

對小牛胸腺DNA濃度與OD值進行一元一次方程回歸擬合標準曲線，回歸方程的相關系數R²＞0.9500；將混合血清樣本的OD值代入標準曲線計算出混合血清樣本中的游離DNA濃度，并調整為200ng/ml，制成ELA2-DNA標準品。

6.根據權利要求5所述的肺癌肝轉移早期診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，還包括：

稱取8g NaC1、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調pH值至7.4，加水定容至1L，121℃、0.1MPa高壓滅菌20min后，制成樣品稀釋液，室溫貯藏備用。