[發(fā)明專利]一種重組釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110201843.8
• 申請(qǐng)日: 2021-02-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112852847B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-02-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石貴陽(yáng);李由然;付聞文;王均華;張梁;丁重陽(yáng);徐沙;顧正華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/60
• 分類號(hào): C12N15/60;C12N9/88;C12N15/81;C12N1/19;C12P5/02;C12R1/865
• 代理公司: 無(wú)錫華源專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32228
• 代理人: 孫建

本發(fā)明公開(kāi)了一種重組釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。其中，α?法尼烯合成酶FSCS的氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。本發(fā)明構(gòu)建了含有該基因的重組表達(dá)載體，建立了生物合成法尼烯的方法。本發(fā)明對(duì)一種此前未明確報(bào)道過(guò)的萜類合成酶進(jìn)行了功能表征，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，在酶學(xué)性質(zhì)的指導(dǎo)下改變發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)了法尼烯在釀酒酵母中的生物合成，相較于已報(bào)道的蘋果來(lái)源法尼烯合成酶有更好的表達(dá)效果，有利于指導(dǎo)法尼烯在微生物中的高效生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種重組釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

α-法尼烯(Farnesene)化學(xué)名為3,7,11-三甲基-1,3,6,10-十二碳四烯，分子式為C15H24，由三個(gè)異戊二烯單元構(gòu)成，相對(duì)分子量為204。法尼烯屬于倍半萜化合物，不溶于水，與十二烷、乙酸乙酯、正己烷等有機(jī)溶劑混溶。自然界中法尼烯有兩種光學(xué)異構(gòu)體，α-法尼烯和β-法尼烯。法尼烯與蘋果虎皮病的發(fā)生有關(guān)，也是一種信息素，能夠誘導(dǎo)昆蟲(chóng)捕食蚜蟲(chóng)等，在植物防御方面有廣泛研究?jī)r(jià)值。此外，法尼烯可作為高效燃料的替代物，并且在香水領(lǐng)域也具有應(yīng)用前景。

法尼烯存在于多種植物的葉片和果實(shí)中，在自然界中含量極低。目前主要通過(guò)原材料提取法、化學(xué)合成法以及微生物合成法獲取法尼烯，原材料提取法穩(wěn)定性差，且受季節(jié)變化影響大；化學(xué)合成法手段復(fù)雜，毒性和成本高。近年來(lái)隨著合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)的快速發(fā)展，構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠成為萜類化合物高效合成的有效手段。

微生物細(xì)胞合成法尼烯需要引入外源法尼烯合成酶，通過(guò)催化底物法尼基焦磷酸生成法尼烯。目前，法尼烯在微生物中的合成主要通過(guò)代謝工程手段對(duì)法尼烯合成途徑中關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，增強(qiáng)前體物質(zhì)供應(yīng)，從而提升法尼烯產(chǎn)量。法尼烯合成酶作為法尼烯合成途徑中的關(guān)鍵酶，對(duì)法尼烯的合成有重要作用。因此選擇高表達(dá)效率的法尼烯合成酶，對(duì)于法尼烯在微生物中的高效生產(chǎn)有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種甜橙來(lái)源萜類合成酶FSCS，并將其與一種蘋果來(lái)源法尼烯合成酶FSAP通過(guò)BLAST進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者序列相似度為56.36％的。其中，F(xiàn)SAP氨基酸序列用SEQ ID No.3所示，核苷酸序列用SEQID No.4所示。本發(fā)明對(duì)甜橙來(lái)源萜類合成酶FSCS進(jìn)行了功能表征以及酶學(xué)性質(zhì)研究，并且本發(fā)明提供了FSCS在釀酒酵母合成法尼烯中的應(yīng)用，并在酶學(xué)性質(zhì)的指導(dǎo)下探究了不同發(fā)酵條件對(duì)法尼烯合成的影響。本發(fā)明得到的α-法尼烯合成酶FSCS生產(chǎn)α-法尼烯產(chǎn)量高，酶活較好。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種α-法尼烯合成酶FSCS基因，所述α-法尼烯合成酶FSCS基因的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

進(jìn)一步的，編碼得到所述α-法尼烯合成酶FSCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種表達(dá)載體，所述的α-法尼烯合成酶FSCS基因。

一種重組釀酒酵母菌株，所述重組釀酒酵母菌株包含所述的α-法尼烯合成酶FSCS基因。

一種重組釀酒酵母菌株的制備方法，所述重組釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法包括如下步驟：將核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的α-法尼烯合成酶FSCS基因克隆入表達(dá)載體中得到重組表達(dá)載體質(zhì)粒Ts gal80-xtpfscs，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞釀酒酵母菌中。

一種重組釀酒酵母菌株的用途，所述重組釀酒酵母菌株在釀酒酵母中發(fā)酵生產(chǎn)α-法尼烯中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述生產(chǎn)α-法尼烯的發(fā)酵培養(yǎng)基為：10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，30g/L的葡萄糖，10％(V/V)十二烷，發(fā)酵條件為：菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)發(fā)酵時(shí)間為24-30h，溫度為30℃，待葡萄糖消耗完畢后變?yōu)?0℃進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵時(shí)間為24-96h。