[發明專利]一種氨氧化細菌的接合轉移方法

在審

• 申請號: 202110199333.1
• 申請日: 2021-02-22
• 公開（公告）號: CN112961877A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 趙辰;李辰宇;王景峰;諶志強;邱志剛;王尚;薛斌;張曦;楊曉波
• 申請（專利權）人: 軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種氨氧化細菌的接合轉移方法，屬于生物工程技術領域。包括：(1)供體菌富集培養、(2)氨氧化細菌富集培養和(3)氨氧化細菌接合轉移步驟，可以將目的質粒有效轉入氨氧化細菌，轉化率高達0.001％，為自養型氨氧化細菌的接合轉移打下基礎。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種氨氧化細菌的接合轉移方法。

背景技術

耐藥基因作為新型環境污染物，已有的研究表明，耐藥基因進入污水生物處理系統后，對生物污水處理效率尤其是脫氮效率產生影響。亞硝化反應是污水系統生物脫氮的關鍵反應，是由氨氧化菌(AOB)完成的，這個過程包括氨單加氧酶(ammoniamonooxygenase,AMO)催化氨成為羥胺，以及羥胺由羥胺氧化酶(Hydroxylamineoxidoreductase,HAO)催化生成亞硝酸鹽。氨氧化菌是革蘭氏陰性菌，歸屬于Proteobacteria門的β-Proteobacteria綱或γ-Proteobacte ria綱，被認為是污水生物處理系統中最為敏感、脆弱的代謝途徑，是系統穩定運行的關鍵環節。目前仍未見到構建載帶有耐藥質粒的氨氧化菌的方法，本方法提供了一種氨氧化細菌ATCC19718的接合轉移方法，可用于構建載帶有耐藥質粒的氨氧化菌模型，用于研究耐藥基因對氨氧化過程的影響及機制。

目前主要建立的接合轉移方法主要針對異養菌如E.coli，氨氧化細菌是一種化能自養菌，目前尚沒有見到關于氨氧化細菌接合轉移方法的相關報道。

因此，如何提供一種氨氧化細菌接合轉移方法是本領域亟待解決的問題。

發明內容

本發明公開了一種氨氧化細菌的接合轉移方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種氨氧化細菌的接合轉移方法，步驟包括：

(1)供體菌富集培養

將目的質粒導入供體菌中，得目的供體菌，而后將供體菌富集培養，得活化目的供體菌；

(2)氨氧化細菌富集培養

將氨氧化細菌富集培養，得活化氨氧化細菌；

(3)氨氧化細菌接合轉移

將活化目的供體菌和活化氨氧化細菌混合并加入緩沖液，調至活化目的供體細菌終濃度為2×10⁸cfu/ml，活化氨氧化細菌終濃度為10⁸cfu/ml；培養4h以上，得接合轉移菌液；

優選的，供體菌為大腸桿菌；

更優選的，供體菌為HB101；

優選的，目的質粒為RP4；

優選的，氨氧化細菌為ATCC19718；

步驟(1)中，活化目的供體菌的濃度為10⁹cfu/mL；

優選的，所述供體菌富集培養基為LB培養基；

優選的，所述供體菌富集培養時間為8h；

步驟(2)中，活化氨氧化細菌的濃度為10⁹cfu/mL；

優選的，所述氨氧化細菌富集培養基成分包括：0.25g/L硫酸銨、1.0g/L磷酸氫二鉀、0.5g/L七水硫酸鎂、2.0g/L氯化鈉、0.4g/L七水合硫酸亞鐵和5.0g/L碳酸鈣，溶液為水；

步驟(3)中，所述緩沖液成分包括：0.5g/L硫酸銨、2.0g/L磷酸氫二鉀、1.5g/L七水硫酸鎂、20g/L胰化蛋白胨、10g/L酵母提取物，1.0g/L七水合硫酸亞鐵和10.0g/L氯化鈉，溶液為水；