[發明專利]一種黃顙魚雜交方法及雜交黃顙魚突變體的培育方法

有效

• 申請號: 202110197431.1
• 申請日: 2021-02-22
• 公開（公告）號: CN113142105B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 冷澤明;龔華祥;張路;董永生;劉國均
• 申請（專利權）人: 眉山市人和漁業專業合作社
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段旺

1.一種雜交黃顙魚突變體的培育方法，其特征在于，該方法包括：

S21、通過黃顙魚雜交方法得到雜交黃顙魚，獲取雜交黃顙魚目標基因組DNA片段，采用DNA限制內切酶對所述雜交黃顙魚目標基因組片段進行消化處理，獲得酶切片段；

所述DNA限制內切酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或與SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90%-99%同源性且編碼相同生物學功能蛋白質的核苷酸序列；

S22、采用DNA連接酶對所述酶切片段進行連接處理，獲得重排DNA片段；

所述DNA連接酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或與SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90%-99%同源性且編碼相同生物學功能蛋白質的核苷酸序列；

S23、將所述重排DNA片段克隆至目標載體上，采用PCR擴增引物對所述目標載體上的重排DNA片段進行PCR擴增處理，獲得擴增產物；

所述PCR擴增引物選自以下三組中的任意一組：

(1) 正向引物5 '-GATCGGTTAACTCGACCGTT-3 '，

反向引物5 '-CTTGCCACGTTAGCTGCTTG-3 '；

(2) 正向引物5 '-GATCAATTAGATCGACCGTT-3 '，

反向引物5 '-CTTGGCTCGTTAGGTGCTTG-3 '；

(3) 正向引物5 '-GATCAATGCTATCGACCCAT-3 '，

反向引物5 '-CTTGGCTCTTACGGTGCAGG-3 '；

S24、將所述擴增產物注入雜交黃顙魚胚胎中，經繁殖培育后獲得雜交黃顙魚目標基因突變體；

所述黃顙魚的雜交方法，包括：

S11、親魚選擇：選擇2-5齡體質健壯、無病無傷的雌魚和雄魚，雌魚尾重100-150g，雄魚尾重400g-450g；

S12、親魚培育：將雌魚和雄魚分養在溶解氧的培育池中，投喂親魚飼料；

S13、親魚管理：產卵前一個月，每隔5-6天沖水一次，且每半個月檢測水質常規指標，確保氨氮低于0 .05mg/L，亞硝酸鹽保持低于0.015mg/L；

S14、人工催產：配制催產注射液，并在親魚的鰭基部注射兩次；

S15、人工授精：按雌雄比例1000：1-1.5配組，取出雄魚精巢，吸干精巢上的血液和水分后，放入研缽中用剪刀剪碎后研碎，加入20倍體積的精子保存液保存備用；然后擠出雌魚魚卵流入瓷盆內，隨即加入精液，攪拌，再加入0.3%-0.5%的氯化鈉溶液，迅速不停地攪拌激活受精；最后用黃泥漿水脫粘，并將受精卵放入孵化桶內流水孵化，密度為30-50萬粒/m³；

S16、孵化管理：調節水流以適應受精卵的發育，出膜平游后下魚苗至暫養池，待魚苗體色全黑并開始分散時，計數后使用高聚乙烯氧氣袋打包后下塘培育，獲得雜交黃顙魚。

2.根據權利要求1所述的雜交黃顙魚突變體的培育方法，其特征在于，所述雌魚為雌黃顙魚/江黃顙魚，所述雄魚為雄瓦氏黃顙魚。

3.根據權利要求1所述的雜交黃顙魚突變體的培育方法，其特征在于，所述S12，包括：

將雌魚和雄魚分養在溶解氧5mg/L以上、水深2米的培育池中，投喂親魚飼料，所述親魚飼料為人工配合膨化飼料，其日投喂量為親魚體重的1%-5%；

并且春季強化培育期間，每周投喂1-2次鮮活餌料，所述鮮活餌料包括小魚、蝦、螺、蚌中的一種或幾種。

4.根據權利要求1所述的雜交黃顙魚突變體的培育方法，其特征在于，在S14中，所述催產注射液由促黃體釋放激素類似物、絨毛膜促性腺激素、地歐酮和0.5%-0.7%的氯化鈉溶液配置而成；

具體注射方法為：

第一針雌魚注射的劑量為促黃體釋放激素類似物15μg/kg-20μg/kg，雄魚不注射；

第二針雌魚注射的劑量為促黃體釋放激素類似物15μg/kg-20μg/kg，絨毛膜促性腺激素1800-2000L.U./kg，地歐酮6-8mg/kg，雄魚注射劑量減半；

注射液用量為雌魚每尾0.2-0.4mL，胸腔注射深度為0.5cm-1cm；在水溫為25-28℃的情況下，兩針的注射間隔為12h。