[發明專利]一種提高組織工程前板層角膜上皮細胞粘附力的方法

在審

• 申請號: 202110197135.1
• 申請日: 2021-02-22
• 公開（公告）號: CN112941014A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 張晉南;王海利;宇詠梅;馬百雙;甘良波
• 申請（專利權）人: 深圳艾尼爾角膜工程有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/38;A61L27/50
• 代理公司: 北京康盛知識產權代理有限公司 11331
• 代理人: 董娣

本發明屬于組織工程技術領域，提供了一種能夠提高組織工程前板層角膜上皮細胞粘附力的方法，包括上皮細胞擴增步驟和前板層角膜構建步驟，所述上皮細胞擴增包括前處理、消化和貼壁培養；所述前板層角膜構建包括涂布、接種和兩階培養。本發明通過將涂布液涂布到脫細胞角膜支架材料的前彈力層上，模擬人體角膜上皮細胞與前彈力層之間的基底膜，起到穩固連接上皮細胞與前彈力層的作用，另外利用氣液面培養的方法，模擬人體眨眼的環境條件進行組織工程前板層角膜的構建，促進角膜上皮細胞復層化；本發明從以上兩個方面保證了含有上皮細胞層的組織工程前板層角膜的臨床使用效果。

技術領域

本發明屬于組織工程技術領域，具體涉及一種在構建組織工程前板層角膜過程中提高角膜上皮細胞粘附力的方法。

背景技術

引起角膜盲的第二大原因是角膜病，角膜病中80％的患者可通過角膜移植來避免致盲。但是受我國角膜捐獻較少，導致同種異體角膜供體匱乏，隨著組織工程學的興起，組織工程角膜材料作為解決因角膜盲病患者帶來了新的希望。組織工程角膜是將天然的動物角膜作為原材料，利用脫細胞的方法去除異種角膜的外源細胞及抗原物質，從而獲得異種的脫細胞角膜支架材料。

脫細胞角膜支架材料在臨床使用時，對于角膜緣未受損傷的患者，可以直接接受脫細胞角膜支架材料的移植，移植后，患者的上皮細胞將以支架材料為支架基礎逐漸生長擴增，直至修復(透明)，但是，對于角膜緣受損傷的患者，由于不具有上皮細胞修復功能，因此這類患者將不能直接接受脫細胞角膜支架材料的移植，必須要在體外培養制備成含有上皮細胞的組織工程角膜，再移植給角膜緣受損的患者進行治療。所以，在脫細胞角膜支架材料上接種和培養上皮細胞形成具有上皮細胞的組織工程角膜時，接種以及體外培養上皮細胞的過程控制將直接影響組織工程角膜的臨床使用效果。

在組織工程角膜的體外培養過程中，接種在脫細胞角膜支架材料上的上皮細胞與前彈力層之間的粘附力決定了組織工程角膜的臨床使用效果。如果粘附力不足，上皮細胞容易脫落，從而影響使用效果，如果粘附力強，上皮細胞與脫細胞角膜支架的前彈力層結合緊密，則結構穩定，不但有利于運輸和保存，而且能保證臨床使用效果。

發明內容

本發明提供一種能夠提高組織工程前板層角膜上皮細胞粘附力的方法，包括上皮細胞擴增步驟和前板層角膜構建步驟，所述上皮細胞擴增包括：前處理、消化和貼壁培養；所述前板層角膜構建包括：涂布、接種和兩階培養；其中，

所述前處理是指將新鮮動物角膜緣組織去除鞏膜、虹膜、結膜組織和內皮層，保留上皮細胞、前彈力層和部分基質層，再用Hank液清洗以適于消化步驟；

所述消化包括用胰酶對上皮細胞和前彈性層進行消化，以使角膜上皮細胞游離；

所述貼壁培養包括將游離的角膜上皮細胞置于第一培養液中進行貼壁擴增培養；

所述涂布包括將涂布液涂布在脫細胞角膜支架材料的前彈力層上；所述涂布液為層黏連蛋白、纖維連接蛋白或膠原蛋白中的一種或多種；

所述接種包括在涂布后的角膜前彈力層上接種經貼壁培養的上皮細胞；

所述兩階培養包括將接種后的角膜前彈力層先浸沒于第二培養液中進行第一階培養，再用第二培養液進行氣液面培養完成第二階培養，制得組織工程前板層角膜。

本發明提供的提高組織工程前板層角膜上皮細胞粘附力的方法，通過將涂布液涂布到脫細胞角膜支架材料的前彈力層上，模擬人體角膜上皮細胞與前彈力層之間的基底膜，起到穩固連接上皮細胞與前彈力層的作用，提高了組織工程前板層角膜上皮細胞的粘附力；另外，本發明提供的提高組織工程前板層角膜上皮細胞粘附力的方法，先浸沒培養使細胞黏附生長，再利用氣液面交替培養的方法，模擬人體眨眼的環境條件進行組織工程前板層角膜的構建，促進角膜上皮細胞復層化；本發明從以上兩個方面保證了含有上皮細胞層的組織工程前板層角膜的臨床使用效果。