[發(fā)明專利]一種提高組織工程前板層角膜上皮細(xì)胞粘附力的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110197135.1
• 申請(qǐng)日: 2021-02-22
• 公開（公告）號(hào): CN112941014A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張晉南;王海利;宇詠梅;馬百雙;甘良波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳艾尼爾角膜工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;A61L27/38;A61L27/50
• 代理公司: 北京康盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11331
• 代理人: 董娣

1.一種提高組織工程前板層角膜上皮細(xì)胞粘附力的方法，包括上皮細(xì)胞擴(kuò)增步驟和前板層角膜構(gòu)建步驟，其特征在于：所述上皮細(xì)胞擴(kuò)增包括：前處理、消化和貼壁培養(yǎng)；所述前板層角膜構(gòu)建包括：涂布、接種和兩階培養(yǎng)；其中，

所述前處理是指將新鮮動(dòng)物角膜緣組織去除鞏膜、虹膜、結(jié)膜組織和內(nèi)皮層，保留上皮細(xì)胞、前彈力層和部分基質(zhì)層，再用Hank液清洗以適于消化步驟；

所述消化包括用胰酶對(duì)上皮細(xì)胞和前彈性層進(jìn)行消化，以使角膜上皮細(xì)胞游離；

所述貼壁培養(yǎng)包括將游離的角膜上皮細(xì)胞置于第一培養(yǎng)液中進(jìn)行貼壁擴(kuò)增培養(yǎng)；

所述涂布包括將涂布液涂布在脫細(xì)胞角膜支架材料的前彈力層上；所述涂布液為層黏連蛋白、纖維連接蛋白或膠原蛋白中的一種或多種；

所述接種包括在涂布后的角膜前彈力層上接種經(jīng)貼壁擴(kuò)增培養(yǎng)的上皮細(xì)胞；

所述兩階培養(yǎng)包括將接種后的角膜前彈力層先浸沒于第二培養(yǎng)液中進(jìn)行第一階培養(yǎng)，再用第二培養(yǎng)液進(jìn)行氣液面培養(yǎng)完成第二階培養(yǎng)，制得組織工程前板層角膜。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述Hank液含有青霉素100U/mL和/或鏈霉素100μg/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述涂布液中層黏連蛋白和/或纖維連接蛋白和/或膠原蛋白的濃度為10-15μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一培養(yǎng)液含有10％-15％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述貼壁培養(yǎng)的溫濕度條件是：37℃，5％飽和濕度；或者，所述貼壁培養(yǎng)步驟每隔24h更換一次第一培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80％時(shí)，將細(xì)胞接種于新的第一培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：在所述涂布步驟之前還包括：脫細(xì)胞角膜支架材料復(fù)水步驟，所述復(fù)水步驟使用的液體為含青霉素和/或硫酸鏈霉素的生理鹽水。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：在所述涂布步驟之后且兩階培養(yǎng)步驟之前還包括孵育步驟，所述孵育步驟的溫濕度條件為：37℃，5％的CO₂飽和濕度。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述接種包括：在涂布后的前彈力層上接種(1-4)×10⁷個(gè)/mL的上皮細(xì)胞懸液，接種量為50μL。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一階培養(yǎng)包括：將接種有上皮細(xì)胞后的角膜前彈力層在第二培養(yǎng)液中浸沒培養(yǎng)5-7天，并且每48h更換一次第二培養(yǎng)液。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二階培養(yǎng)包括：將經(jīng)過第一階培養(yǎng)的接種有上皮細(xì)胞后的角膜前彈力層置于第二培養(yǎng)液中進(jìn)行氣液面培養(yǎng)7-15天，每隔2-3天更換一次第二培養(yǎng)液。