[發明專利]一種高效液相色譜分離測定高純纈氨酸中雜氨基酸的方法

有效

• 申請號: 202110191041.3
• 申請日: 2021-02-20
• 公開（公告）號: CN112858522B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 劉勛
• 申請（專利權）人: 重慶工貿職業技術學院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種高效液相色譜分離測定高純纈氨酸中雜氨基酸的方法，具體涉及液相色譜分離氨基酸技術領域，具體步驟如下：步驟一：儀器與試劑的準備；步驟二：制樣；步驟三：色譜分析。本發明通過直接采用紫外檢測器在204nm檢測，采用疏水性較弱的C8反相鍵合色譜柱，以磷酸鹽緩沖溶液與乙腈的混合溶液為流動相，并添加適當濃度的戊烷磺酸鈉溶液，具有準確度高，線性范圍寬，重現性好的特點，不需要衍生操作和復雜的樣品前處理，纈氨酸與各雜質氨基酸之間的分離較好，出峰時間較快，檢測時間短，方法具有較高的靈敏度，能夠較好地實現對高純纈氨酸品質的檢測，有利于滿足生產過程中對高純纈氨酸產品質量控制的需要。

技術領域

本發明實施例涉及液相色譜分離氨基酸技術領域，具體涉及一種高效液相色譜分離測定高純纈氨酸中雜氨基酸的方法。

背景技術

纈氨酸是組成蛋白質的20種氨基酸之一，化學名稱為2-氨基-3-甲基丁酸，屬于支鏈氨基酸，也是人體必需的8種氨基酸和生糖氨基酸，它與其他兩種支鏈氨基酸（異亮氨酸和亮氨酸）一起工作促進身體正常生長，修復組織，調節血糖，并提供需要的能量。

纈氨酸通常采用發酵法生產，受工藝條件的限制，從發酵液中提取生產的工業級纈氨酸常含有丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等雜氨基酸。

纈氨酸是制備酮纈氨酸鈣等原料藥的起始原料，對纈氨酸原料的質量要求很高，特別是對其中雜氨基酸的含量有嚴格的限量標準。這種高純纈氨酸通常采用特別的精制提純工藝來生產。在這一系列生產和應用高純纈氨酸的過程中往往需要對產品質量進行檢測，特別是對其中雜氨基酸進行檢測。

氨基酸分析可以使用專用氨基酸分析儀來完成。氨基酸分析儀是采用陽離子交換色譜法對氨基酸進行分離，并進行定性和定量分析的儀器。樣品中的氨基酸經離子交換色譜柱分離，分離出的單個氨基酸組分在柱后與茚三酮試劑反應，生成紫色化合物，用可見光檢測器測量其在570nm的吸光度，與標準溶液的吸光度比較，即可計算出樣品中氨基酸的含量。專用氨基酸分析儀價格昂貴，用途單一，操作繁瑣，分析時間長。

氨基酸分析也可以使用高效液相色譜儀來完成。通常采用反相柱分離，柱前或柱后衍生紫外檢測的方法。但這些方法都需要進行衍生反應，操作繁瑣，分析時間長，一個樣品通常需1h。還需要進行梯度洗脫，對高效液相色譜儀及對配制流動相的試劑要求較高。

高純纈氨酸中的雜氨基酸主要指丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸，其它氨基酸一般不存在。只要能將這幾種雜氨基酸以及纈氨酸相互分離即可，因此有可能找到一種簡便的液相色譜分離方法，實現這幾種雜氨基酸的分離。但由于主成分纈氨酸的含量高達99%以上，而雜氨基酸的含量大致在0.01%~0.5%，兩者相差可達10000倍，在這種高濃度背景中準確測定低濃度雜氨基酸的含量仍比較困難。

因此，需要建立一種簡便、快速、準確地測定高純纈氨酸中雜氨基酸含量的分析方法，以滿足高純纈氨酸生產過程中質量控制的需要。

發明內容

為此，本發明實施例提供一種高效液相色譜分離測定高純纈氨酸中雜氨基酸的方法，通過直接采用紫外檢測器在204nm檢測，避免了對樣品組分進行衍生反應，簡化了操作步驟，縮短了分析時間，得到了較高的檢測靈敏度；通過采用疏水性較弱的C8反相鍵合柱，提高了氨基酸組分的分離度，以磷酸鹽緩沖溶液與乙腈的混合溶液為流動相，并添加適當濃度的戊烷磺酸鈉溶液，戊烷磺酸根陰離子與帶正電荷的氨基酸組分形成離子對結合物，降低了氨基酸組分被色譜柱載體上可能存在的硅羥基吸附的機會，使色譜峰拖尾減小，采取本發明提供的液相色譜條件，實現了纈氨酸與各雜質氨基酸之間的分離，以解決現有技術中由于專用氨基酸分析儀價格昂貴，用途單一，柱前或柱后衍生紫外檢測氨基酸的方法操作繁瑣，分析時間長，對高效液相色譜儀及對配制流動相的試劑要求高，分離檢測雜氨基酸的準確性低的問題。

為了實現上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：一種高效液相色譜分離測定高純纈氨酸中雜氨基酸的方法，具體步驟如下：