[發(fā)明專利]一種培養(yǎng)犬瘟熱病毒和犬細小病毒的方法及應用

在審

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• 申請日: 2021-02-18
• 公開（公告）號: CN112795530A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范金秀;徐高原;蔡潮;焦利紅;韋陽飛;謝月嬌;劉新穎;明靜芳;陳亮;陳關(guān)平;韓進;洪燈
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 錢云

本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種培養(yǎng)犬瘟熱病毒和犬細小病毒的方法。所述方法包括以Vero細胞作為犬瘟熱病毒的宿主，以F81細胞作為犬細小病毒的宿主，通過生物反應器進行培養(yǎng)；所述生物反應器中載體為片狀載體。本發(fā)明通過生物反應器進行犬瘟熱病毒和犬細小病毒的培養(yǎng)，以Vero細胞作為犬瘟熱病毒的宿主，以F81細胞作為犬細小病毒的宿主在片狀載體上進行培養(yǎng)，生產(chǎn)得到的犬瘟熱病毒和犬細小病毒滴度高，批間差異小，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種培養(yǎng)犬瘟熱病毒和犬細小病毒的方法及應用。

背景技術(shù)

狗是人類重要的伴侶動物之一，寵物產(chǎn)業(yè)市場目前正呈現(xiàn)快速發(fā)展的勢頭，城市寵物狗的數(shù)量也相應地增多。因此，加強對犬主要疾病的防控是當務之急，疫苗免疫被認為是犬病防控的最直接有效的措施。

犬瘟熱病毒(CDV)病和犬細小病毒(CPV)病是當前對養(yǎng)犬業(yè)危害嚴重的兩種病毒性傳染病。經(jīng)常引起大批犬、貂和狐等動物發(fā)病，經(jīng)濟損失慘重。CDV可以感染包括大熊貓、小熊貓以及獅、虎和豹等食肉目所有8個科、偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動物，發(fā)病率可達100％，病死率達80％。CPV可引起犬出血性腸炎與心肌炎。此外，CPV還可引起虎、獅、果子貍和猴等野生動物的感染。

目前，培養(yǎng)犬瘟熱和犬細小病毒制備疫苗的方法多采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝。傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝與當前大規(guī)模動物疫苗生產(chǎn)不相適應，主要表現(xiàn)在(1)轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)，不能做到培養(yǎng)條件適時調(diào)整，無法保證細胞處于最佳狀態(tài)，培養(yǎng)細胞密度小，生產(chǎn)病毒滴度低；(2)轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)，細胞批間差異大，產(chǎn)品質(zhì)量不均一、不穩(wěn)定；(3)轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)操作流程復雜，污染風險大；(4)轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)，生產(chǎn)效率低，費時費力。面對當前市場形勢，需要一種可以大規(guī)模培養(yǎng)高病毒滴度犬瘟熱和犬細小病毒的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)犬瘟熱病毒和犬細小病毒的方法及應用，通過生物反應器以片狀載體進行兩種病毒的培養(yǎng)，生產(chǎn)病毒滴度高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

第一方面，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)犬瘟熱病毒和犬細小病毒的方法，包括：

以Vero細胞作為犬瘟熱病毒的宿主，以F81細胞作為犬細小病毒的宿主，通過生物反應器進行培養(yǎng)；

所述生物反應器中載體為片狀載體。

目前，通過生物反應器培養(yǎng)Vero細胞和F81細胞這類貼壁細胞常采用微載體和片狀載體。微載體指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。片狀載體采用適合于細胞貼壁、生長的聚酯纖維，經(jīng)過超聲波處理、加工而成，為細胞生長提供足夠的表面空間。本發(fā)明在實驗中采用發(fā)現(xiàn)采用微載體時，當細胞和病毒同時接種后，細胞無法持續(xù)附著在微載體表面生長，而本發(fā)明通過進一步實驗摸索采用片狀載體可以使得接種了犬瘟熱病毒和犬細小病毒的Vero細胞和F81細胞正常生長，并且生長狀態(tài)良好，生產(chǎn)病毒滴度較高。

進一步地，所述片狀載體為聚酯纖維片狀載體。

進一步地，所述生物反應器為固定床籃式攪拌槳反應器。

進一步地，所述Vero細胞在進行培養(yǎng)前的接種密度為4-5×10⁵cell/mL；所述F81細胞在進行培養(yǎng)前的接種密度為3-4×10⁵cell/mL。

進一步地，所述Vero細胞和所述F81細胞在培養(yǎng)時用的培養(yǎng)基均為包含1.8％～2.2％新生牛血清的199培養(yǎng)基，pH為7.0～7.2。

本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基為199低血清培養(yǎng)基(可市售購得)，F(xiàn)81細胞和Vero細胞在該培養(yǎng)基2％血清含量就可以和其他培養(yǎng)基(例如DMEM)10％血清含量下取的類似的培養(yǎng)效果。

進一步地，所述Vero細胞的培養(yǎng)條件為：