[發明專利]連接核酸與蛋白或肽的方法

在審

• 申請號: 202110186703.8
• 申請日: 2021-02-09
• 公開（公告）號: CN112851771A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 門冬;張先恩;周昆;曹姍姍;周娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C07K14/315
• 分類號: C07K14/315;C07K14/435;C12N9/90;C12N9/02;C12N9/10;A61K47/42;A61K47/54
• 代理公司: 北京布瑞知識產權代理有限公司 11505
• 代理人: 孟潭

本發明提供了一種連接核酸與蛋白或肽的方法，涉及生物交聯的技術領域。上述連接核酸與蛋白或肽的方法，包括以下步驟：(1)目標蛋白或肽與DNA拓撲異構酶形成融合蛋白；(2)融合蛋白中的DNA拓撲異構酶催化共價連接目標核酸。本發明利用DNA拓撲異構酶能夠識別、剪切和連接特定的目標核酸序列的性質，實現了穩定、高效、定點、定向共價連接目標核酸與目標蛋白或肽，而且不影響蛋白及核酸的結構或性能。

技術領域

本發明涉及涉及生物交聯的技術領域，具體涉及基于DNA拓撲異構酶催化的核酸與蛋白或肽的定點共價連接，以及蛋白核酸復合物。

背景技術

蛋白質作為所有生命活動的承擔者，功能多種多樣，例如轉運蛋白運輸貨物，細胞表面蛋白受體接收并傳遞信號，蛋白酶催化一系列生化反應等。而以核酸結構為指導，可以構建出結構精密、功能多樣的核酸-蛋白復合物。目前核酸與蛋白的連接方法按連接形式分為非共價結合以及共價結合。現有的非共價結合方法主要有：親和素(或鏈霉親和素)與生物素的作用，通過在蛋白上修飾生物素(或融合親和素)與偶聯親和素(修飾生物素)的核酸相互作用，來實現蛋白核酸連接；金屬離子與蛋白識別結構域的結合，如鎳離子與聚組氨酸的結合，通過在蛋白上融合寡聚組氨酸，核酸上修飾nitrilotriacetic acid(NTA)，在聚組氨酸-鎳離子-NTA的螯合下，實現蛋白核酸連接；抗原抗體的親和以及蛋白的核酸適配體也是重要的非共價結合手段。目前共價結合主要通過化學交聯，如利用蛋白表面的氨基與烷硫基(Alkylthiol)修飾的核酸在交聯劑(如sSMCC)的作用下形成共價結合；通過在蛋白上修飾MKHKGS短肽以及核酸上修飾Z-QG(N-carbobenzyloxy glutaminyl glycine)，在谷氨酰胺轉移酶(transglutaminase)的作用下產生共價結合。

目前存在的核酸蛋白結合方法中，非共價結合親和力低、受環境影響大。而共價結合技術中，修飾過程易造成蛋白變性、蛋白與核酸交聯隨機性大。因此，目前蛋白核酸連接技術有待發展，急需要一種穩定、高效、反應條件溫和的共價定點連接技術。

發明內容

有鑒于此，本發明致力于提供一種連接核酸與蛋白或肽的方法，利用DNA拓撲異構酶能夠識別、剪切和連接特定目標核酸序列的性質，實現了穩定、高效、定點、定向共價連接目標核酸與目標蛋白或肽，而且不影響蛋白及核酸的結構或性能。

本發明第一方面提供了一種連接核酸與蛋白或肽的方法，包括以下步驟：

(1)目標蛋白或肽與DNA拓撲異構酶形成融合蛋白；

(2)融合蛋白中的DNA拓撲異構酶催化共價連接目標核酸。

DNA拓撲異構酶為催化DNA拓撲學異構體互相轉變的酶的總稱，是普遍存在的核酶(nuclear enzymes)，其主要作用是釋放DNA的超螺旋和扭轉張力來促進DNA復制、轉錄、重組和染色質重塑，通過在DNA上產生一個暫時的單鏈或者雙鏈缺口，同時在酶活性位點的酪氨酸與斷裂鏈的一端產生一個暫時的磷酸二酯鍵來催化DNA鏈的斷裂和結合。DNA拓撲異構酶可以分成兩類：Type I:類型一的酶功能上為剪切引入暫時單鏈DNA缺口。Type II：類型二的酶功能上為剪切引入暫時雙鏈DNA缺口。

本發明的發明人發現，雖然目前連接蛋白和核酸的技術手段眾多，但并沒有現有技術提出使用DNA拓撲異構酶催化連接蛋白和核酸。本發明利用DNA拓撲異構酶在催化DNA鏈的斷裂和結合方面的性質，將DNA拓撲異構酶先與目標蛋白或肽組裝成融合蛋白，再利用融合蛋白中的DNA拓撲異構酶催化共價連接目標核酸，實現了穩定、高效、定點、定向共價連接目標核酸與目標蛋白或肽。