[發明專利]一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法

在審

• 申請號: 202110185662.0
• 申請日: 2021-02-11
• 公開（公告）號: CN112695139A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 姜自紅;賈雪晴
• 申請（專利權）人: 滁州職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇法德東恒律師事務所 32305
• 代理人: 劉林

本發明公開了一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，其特征在于：具體包括以下方法，具體包括有，S1，引物與探針的設計；S2，定量標準品的制備；S3，引物探針的篩選；S4，3重實時熒光定量PCR擴增體系的優化；S5，3重實時熒光定量PCR擴增程序優化；S6，性能評價；S7，樣本測試試驗。本發明建立了針對CVB、TAV和CChMVd 3種菊花病毒/類病毒的多重實時熒光RT?PCR檢測體系，適用于菊花病毒病的日常篩查與檢驗，還可為菊花品種的進出口檢驗提供技術支持。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體為一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法。

背景技術

菊花為菊科菊屬多年生草本植物，是我國傳統名花，是世界四大切花之一，具有重要的經濟價值。菊花主要通過扦插繁殖，其過程利于病毒的積累和傳播，從而致使菊花品種退化，品質和產量嚴重下降。已報道侵染菊花的病毒有20多種，主要包括菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)、菊花莖壞死病毒(Chrysanthemum stem necrosis virus， CSVN)5種病毒和菊花褪綠斑駁類病毒(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid，CChMVd)、菊花矮化類病毒(Chrysanthemum stunt viroid，CSVd) 2種類病毒。CVB為香石竹潛隱病毒屬RNA病毒，是危害菊花的主要病毒之一，患病菊花表現為輕型花葉癥或不表現癥狀，感病菊花形成明顯的花葉癥狀或壞死斑，嚴重感病的產生褐色枯斑。CVB既可通過汁液和扦插條傷口傳播，也可通過桃蚜和馬鈴薯傳播，觀賞菊花上普遍發生，自然侵染率達到26.55％。 TAV也是RNA病毒，其引起的菊花不孕病毒病呈現出花葉、病葉扭曲、病株萎縮和花色不正常等癥狀，自然侵染率達19.27％。CChMVd是一種類病毒，主要引起菊花褪綠、枯黃、斑點等癥狀。

菊花在栽培中往往會同時受到幾種病毒/類病毒的復合侵染，由病毒病引起的菊花種質退化、質量下降，已成為菊花生產上的一個突出問題，目前尚無有效的藥劑能防治菊花病毒病，早發現并及時拔除病株和使用脫毒種苗是防止菊花病毒病的最佳辦法。植物病毒的檢測方法主要包括指示植物檢測法、電子顯微鏡技術、血清學方法和分子生物學方法等，這些方法在特異性、靈敏度和準確性方面均存在不足，容易造成假陽性或假陰性現象。RT-PCR是將 RNA病毒的反轉錄與PCR擴增結合的檢測技術。過往的菊花病毒的PCR檢測研究多集中于一種或兩種菊花病毒的RT-PCR定性檢測，難以對菊花病毒載量準確定量，檢測靈敏度和效率相對較低。而菊花在生長過程中往往同時受到多種病毒的復合感染。因此，有必要建立一種可同時對多種菊花病毒快速、定量的檢測方法。為此，需要設計相應的技術方案解決存在的技術問題。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術不足，本發明提供了一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，解決了：現有的菊花病毒的PCR檢測研究多集中于一種或兩種菊花病毒的RT-PCR定性檢測，難以對菊花病毒載量準確定量，檢測靈敏度和效率相對較低的問題。

(二)技術方案

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，具體包括以下方法，具體包括有，S1，引物與探針的設計；

S2，定量標準品的制備；

S3，引物探針的篩選；

S4，3重實時熒光定量PCR擴增體系的優化；

S5，3重實時熒光定量PCR擴增程序優化；

S6，性能評價；