[發(fā)明專利]一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110185662.0
• 申請日: 2021-02-11
• 公開（公告）號: CN112695139A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜自紅;賈雪晴
• 申請（專利權(quán)）人: 滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇法德東恒律師事務(wù)所 32305
• 代理人: 劉林

1.一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，其特征在于：具體包括以下方法，具體包括有，S1，引物與探針的設(shè)計；

S2，定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備；

S3，引物探針的篩選；

S4，3重實時熒光定量PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化；

S5，3重實時熒光定量PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化；

S6，性能評價；

S7，樣本測試試驗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，其特征在于：步驟S1中，首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載CVB、TAV、CChMVd3種菊花病毒/類病毒全基因組序列，用MEGA6.06生物學(xué)軟件進(jìn)行比對，分別在CVB和TAV的編碼外殼蛋白基因、CChMVd類病毒的保守區(qū)域設(shè)計引物探針，引物探針設(shè)計軟件為Primer Express 2.0和primer premier5.0，每種病毒/類病毒設(shè)計2條正鏈引物，2條負(fù)鏈引物，1條探針，即4種引物探針組合。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，其特征在于：步驟S2中，RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備：體外合成含有pGEM-T載體的CVB、TAV、CChMVd 3種病毒/類病毒目的基因片段的質(zhì)粒，采用EcoR I酶切下含有T7啟動子的目的片段測序鑒定后SacI酶切線性化，酶切產(chǎn)物純化回收后，用T7High Efficiency Transcription Kit體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)測定的濃度換算成拷貝數(shù)，采用Carry RNA稀釋液10倍梯度稀釋成定量標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為：1.0×1010拷貝/mL、1.0×109拷貝/mL、1.0×108拷貝/mL、1.0×107拷貝/mL、1.0×106拷貝/mL、1.0×105拷貝/mL、1.0×104拷貝/mL、1.0×103拷貝/mL)，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，其特征在于：步驟S3中，具體方法包括25μL反應(yīng)體系：12.5μL 2×Hot-Start HiTaq RT-PCR Mix，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)、探針0.25μL(10μmol/L)、Mg2+2.0μL(25mmol/L)、dNTPs0.5μL(10mmol/L)，模板5μL，補(bǔ)水至25μL，以1.0×1010拷貝/mL～1.0×103拷貝/mL的病毒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，對上述設(shè)計3種病毒/類病毒的2組引物探針組合進(jìn)行篩選，RT-PCR擴(kuò)增程序：50℃25min，1循環(huán)；95℃5min，1循環(huán)；95℃10s，60℃40s(熒光收集)，40循環(huán)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，其特征在于：步驟S4中，包括探針濃度優(yōu)化，固定3種病毒/類病毒引物濃度為200nmol/L，設(shè)置3個不同探針濃度水平(80nmol/L、100nmol/L、120nmol/L)，用10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×107拷貝/mL～1.0×103拷貝/mL)及陰性對照作為待測標(biāo)本，結(jié)合其它反應(yīng)試劑組分，測試不同探針濃度對擴(kuò)增結(jié)果的影響。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，其特征在于：步驟S4中，包括引物濃度優(yōu)化，根據(jù)確定的探針濃度，按照引物探針1∶1、2∶1和3∶1的比例，用10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×107拷貝/mL～1.0×103拷貝/mL)及陰性對照作為待測標(biāo)本，結(jié)合其它反應(yīng)試劑組分，測試不同引物濃度對擴(kuò)增結(jié)果的影響。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測多種菊花常見病毒/類病毒的檢測方法，其特征在于：步驟S4中，包括Mg2+濃度優(yōu)化，根據(jù)優(yōu)化的引物和探針濃度，設(shè)置4個不同的Mg2+濃度水平(2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L)，用10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×107拷貝/mL～1.0×103拷貝/mL)及陰性對照作為待測標(biāo)本，結(jié)合其它試劑組分，測試不同Mg2+濃度對擴(kuò)增結(jié)果的影響。