[發(fā)明專利]同時(shí)檢測(cè)牛輪狀病毒、冠狀病毒和病毒性腹瀉病毒的三重?zé)晒舛縋CR試劑盒及應(yīng)用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110182882.8
• 申請(qǐng)日: 2021-02-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112760421A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳華林;張丹;劉鄧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京三元集團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯智英財(cái)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11301
• 代理人: 張瑋瑋

本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重?zé)晒舛縋CR試劑盒及應(yīng)用，屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，包括針對(duì)牛輪狀病毒、冠狀病毒、病毒性腹瀉病毒的三組特異性引物和三個(gè)相應(yīng)的探針。本發(fā)明用于檢測(cè)三種病毒的引物和探針具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)效率高的優(yōu)點(diǎn)；該三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒具有擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)效果穩(wěn)定，重復(fù)性好的特點(diǎn)，適用于奶牛腹瀉致病原檢測(cè)、定期監(jiān)測(cè)，以及奶牛腹瀉流行病學(xué)調(diào)查等；應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒在一個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中能夠同時(shí)檢測(cè)三種奶牛腹瀉致病原，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間、降低了檢測(cè)成本，且能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，檢測(cè)效率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種牛腹瀉病原體檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種同時(shí)檢測(cè)牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的試劑盒，屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

牛輪狀病毒、冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒是引起牛病毒性腹瀉的重要病原。隨著我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；s化高度發(fā)展，牛腹瀉，尤其是新生犢牛腹瀉成為困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一，嚴(yán)重危害牛群健康并阻礙我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

牛輪狀病毒((Bovine Rotavirus,BRV)病是由輪狀病毒引起的多種幼齡動(dòng)物和嬰幼兒的急性胃腸道傳染病，以精神委頓、厭食、嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征。本病病原為輪狀病毒，病毒粒子呈圓形，似車輪狀。病毒對(duì)外界因素的抵抗力較強(qiáng)，在糞便和不含抗體的乳汁中，經(jīng)半年仍有感染性。患者及隱性感染者的糞便內(nèi)含有大量的輪狀病毒，并可經(jīng)消化道傳染給易感人畜。在人和各種動(dòng)物間有一定交互感染作用，只要病毒在人或一種動(dòng)物中持續(xù)存在，就有可能造成本病在自然界中長(zhǎng)期傳播。本病主要發(fā)生在犢牛，發(fā)病日齡主要為15～90天。春、秋兩季發(fā)病較多。病毒存在于腸道，隨糞便排出體外，經(jīng)消化道感染。

牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCV)是引起新生犢牛腹瀉的一種重要的病原，還可引起牛的呼吸道感染和成年牛的冬季血痢。自從1973年美國(guó)Mebus等人首次報(bào)道該病原以來(lái)，隨后證明BCV在世界范圍內(nèi)廣泛分布，在許多國(guó)家和地區(qū)牛群中流行。1987年，國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道在我國(guó)牛群中也流行該病。BCV引起的犢牛腹瀉僅次于輪狀病毒，并且可導(dǎo)致人的腹瀉。

牛病毒性腹瀉性病毒((Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)，屬于黃病毒科瘟病毒屬，病牛的分泌物、排泄物、血液和脾臟等都含有病毒，以直接接觸或間接接觸方式傳播。

牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛腹瀉性病毒是引起犢牛腹瀉的重要病原，三種病毒引起的腹瀉臨床癥狀相似、發(fā)病急、易混合感染；實(shí)際生產(chǎn)中牧場(chǎng)因?yàn)椴≡淮_定，無(wú)鑒別診斷或診斷不及時(shí)等因素，對(duì)犢牛腹瀉不能采取對(duì)癥治療，致使?fàn)倥８篂a發(fā)病率達(dá)70％，死亡率高達(dá)50％，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。解決我國(guó)牧場(chǎng)犢牛腹瀉防控困境的關(guān)鍵是快速有效的對(duì)癥治療和針對(duì)性預(yù)防措施的有效結(jié)合，因此建立針對(duì)牛輪狀病毒、冠狀病毒和牛腹瀉性病毒的實(shí)驗(yàn)室快速鑒別診斷方法，特別是快速確定傳染性病原方法，為牛場(chǎng)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的對(duì)癥治療和精準(zhǔn)采取預(yù)防性措施是當(dāng)前緊迫需求。

目前，分別檢測(cè)牛輪狀病毒、冠狀病毒和牛腹瀉性病毒的技術(shù)一般來(lái)說(shuō)有三類，血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗(yàn)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。包括病毒分離、中和試驗(yàn)、電鏡觀察、ELISA、RT-PCR、免疫熒光、熒光定量PCR等。

血清學(xué)診斷技術(shù)包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳技術(shù)、免疫熒光、免疫電鏡技術(shù)和ELISA。在這些技術(shù)中,ELISA方法用于高通量實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，但是檢測(cè)靈敏性低于熒光定量PCR，而且只能定性不能定量。其他檢測(cè)方法，由于試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、材料多、檢測(cè)具有明顯滯后性而且重復(fù)性差，多用于科研很少用于實(shí)際生產(chǎn)中檢測(cè)。

生物學(xué)試驗(yàn)包括病毒細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物試驗(yàn)。這種檢測(cè)方法敏感性低、成本高、周期長(zhǎng)，主要用于科研特殊需要，基本不用于生產(chǎn)中病原檢測(cè)。