[發明專利]同時檢測牛輪狀病毒、冠狀病毒和病毒性腹瀉病毒的三重熒光定量PCR試劑盒及應用方法

在審

• 申請號: 202110182882.8
• 申請日: 2021-02-10
• 公開（公告）號: CN112760421A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 陳華林;張丹;劉鄧
• 申請（專利權）人: 北京三元集團畜牧獸醫總站
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯智英財專利代理事務所(普通合伙) 11301
• 代理人: 張瑋瑋

1.一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：包括針對牛輪狀病毒、冠狀病毒、病毒性腹瀉病毒的三組特異性引物和三個相應的探針。

2.根據權利要求1所述的一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述針對牛輪狀病毒的特異性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，對應的探針核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述針對牛冠狀病毒的特異性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，對應的探針核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述針對牛病毒性腹瀉病毒的特異性引物上游核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，對應的探針核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根據權利要求1所述的一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述三個探針的5’端均標記有熒光報告基團，3’端均標記有熒光淬滅基團。

4.根據權利要求3所述的一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述熒光報告基團選自NED、FAM和JOE，所述熒光淬滅基團為BHQ1。

5.根據權利要求1所述的一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒的反應體系包括熒光定量PCR反應液、逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶、標準陽性RNA模板。

6.根據權利要求5所述的一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述標準陽性RNA模板是采用T7體外轉錄試劑盒制備得到的牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒的標準RNA。

7.根據權利要求5所述的一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述反應體系所需各物質的量為：12.5μL的熒光定量PCR反應液，1μL的逆轉錄酶，1.5μL的TaqDNA聚合酶，牛輪狀病毒的特異性上游引物、特異性下游引物、特異性熒光探針各1μL，牛冠狀病毒的特異性上游引物、特異性下游引物、特異性熒光探針各1μL，牛病毒性腹瀉病毒的特異性上游引物、特異性下游引物、特異性熒光探針各1μL，陰性對照1μL，標準陽性RNA模板1μL。

8.一種權利要求1-7任一項所述的同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒的應用方法，其特征在于：所述試劑盒用于奶牛腹瀉致病原檢測，牛場腹瀉病原定期監測，以及奶牛腹瀉流行病學調查；所述奶牛腹瀉致病原為牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒這三種。

9.根據權利要求8所述的一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒的應用方法，其特征在于：包括如下檢測步驟：

S1選取待測樣品，提取RNA備用；所述待測樣品為牛的糞便或血液；

S2取試劑盒，按照每個PCR擴增體系中加入1μL步驟S1得到的樣品RNA進行擴增反應；PCR擴增反應條件為42℃ 30min，95℃預變性1min；95℃15s，53℃40s，40個循環；

S3記錄檢測結果，根據檢測結果判斷牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的有無及含量。

10.根據權利要求9所述的一種同時檢測牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒的應用方法，其特征在于：所述試劑盒RNA的檢測范圍為10¹-10⁹拷貝/μL。