[發(fā)明專利]一種用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的亞洲棉根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的解離方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110181753.7
• 申請日: 2021-02-09
• 公開（公告）號: CN113046291B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉乾坤;李鵬濤;韋洋洋;程爽;劉玉玲;盧全偉;周忠麗;蔡小彥;王玉紅;劉方;彭仁海
• 申請（專利權(quán)）人: 安陽工學(xué)院;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 北京易捷勝知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11613
• 代理人: 齊勝杰

本發(fā)明涉及一種用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的亞洲棉根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的解離方法，該方法包括亞洲棉種子的萌發(fā)、組織培養(yǎng)、酶解解離原生質(zhì)體、離心收集原生質(zhì)體以及顯微觀察鑒定等步驟。本發(fā)明從亞洲棉的根尖和葉片所解離的原生質(zhì)體濃度較高(高于3000cells/μL)，且活率不低于92％，完全符合10×Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的上機(jī)要求。因此本發(fā)明得出的根尖與葉片解離原生質(zhì)體的方法，更好的解決了亞洲棉根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體解離困難以及活率低的難題，從而可以更好的研究棉花抗逆過程特定基因的表達(dá)，對于棉花的遺傳發(fā)育與培育抗逆棉花的品種至關(guān)重要。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的亞洲棉根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的解離方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)與普通生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

植物細(xì)胞不同于動物細(xì)胞，它有細(xì)胞壁的保護(hù)。植物原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁的由細(xì)胞膜包裹的裸露細(xì)胞，本身具有細(xì)胞的全能性。目前植物細(xì)胞原生質(zhì)體制備過程中，有兩大難題，酶解時間與緩沖液滲透壓。植物組織伴隨著發(fā)育程度和功能的不同，具有不同的細(xì)胞壁厚度和液泡滲透壓，這為不同植物組織間甚至是復(fù)雜植物組織內(nèi)的單細(xì)胞分析造成了一定的障礙。

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是紡織品的主要原料之一，在國民經(jīng)濟(jì)和人民生活中占有重要地位。亞洲棉是一個二倍體棉種，具有纖維強(qiáng)力高，抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良性狀。盡管棉花是耐鹽先鋒作物，但耐鹽能力有限，不足以對我國大環(huán)境的鹽漬土壤形成耐受性。隨著城鎮(zhèn)化發(fā)展和人類活動對土壤環(huán)境的污染，可耕作土地面積逐漸減少，而糧棉爭地的矛盾日益顯現(xiàn)，培育適宜我國土壤和氣候環(huán)境的耐鹽和抗旱棉花品種顯得尤為重要。

棉花根尖是面對非生物脅迫最先做出反應(yīng)的部位，因此，研究根尖細(xì)胞的發(fā)育軌跡以及響應(yīng)非生物脅迫的基因?qū)τ谔岣呙藁望}與抗旱的特性至關(guān)重要。棉花葉肉細(xì)胞位于上、下表皮之間，葉肉細(xì)胞內(nèi)含有大量的葉綠體，是植物進(jìn)行光合作用的主要部分。

10×Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序是近幾年在生物科研領(lǐng)域比較熱門的技術(shù)之一。它不同于目前一般的普通轉(zhuǎn)錄組測序，可以很精確的研究植物細(xì)胞上的某一個部位，比如研究氣孔譜系細(xì)胞的發(fā)育，研究雄性不育過程的花粉敗育。而常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測序只能檢測植物所有部位的平均表達(dá)量，往往解決不了細(xì)胞的異質(zhì)性。

現(xiàn)有技術(shù)制備的棉花根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體，其數(shù)量與活率均不能滿足10×Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的上機(jī)要求，如何能制備出棉花根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體，使其數(shù)量與活率分別滿足10×Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的上機(jī)要求，從而可以更好的研究棉花抗逆過程特定表達(dá)的基因，對于棉花的遺傳發(fā)育與培育抗逆棉花的品種至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容

(一)要解決的技術(shù)問題

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，本發(fā)明提供一種用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的亞洲棉根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的解離方法。

(二)技術(shù)方案

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案包括：

一種用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的亞洲棉根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的解離方法，其包括如下步驟：

(1)培養(yǎng)獲得亞洲棉的根尖和葉肉組織；

(2)將根尖與葉肉組織分別加入酶解液進(jìn)行培養(yǎng)；

(3)向步驟(2)中處理后的酶解液中加入使原生質(zhì)體釋放的溶液(原生質(zhì)體釋放液)，之后細(xì)胞篩過濾，低速離心，棄上清；

(4)向步驟(3)中保留的溶液中加入原生質(zhì)體釋放液，重新懸浮原生質(zhì)體，細(xì)胞篩過濾，低溫低速離心，棄上清，加入原生質(zhì)體釋放液重新懸浮原生質(zhì)體；

(5)將步驟(4)中獲得的原生質(zhì)體置于冰上，重新懸浮原生質(zhì)體，取原生質(zhì)體懸浮液加入臺盼藍(lán)染色液在載玻片上通過顯微鏡鏡檢，計算細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞活率。