[發(fā)明專利]一種用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的亞洲棉根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的解離方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110181753.7
• 申請(qǐng)日: 2021-02-09
• 公開（公告）號(hào): CN113046291B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉乾坤;李鵬濤;韋洋洋;程爽;劉玉玲;盧全偉;周忠麗;蔡小彥;王玉紅;劉方;彭仁海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安陽工學(xué)院;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04
• 代理公司: 北京易捷勝知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11613
• 代理人: 齊勝杰

1.一種用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的亞洲棉根尖細(xì)胞與葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的解離方法，其特征在于，

其包括如下步驟：

(1)分別培養(yǎng)獲得亞洲棉的根尖和葉肉組織；

(2)將根尖與葉肉組織分別加入酶解液進(jìn)行培養(yǎng)；

(3)向步驟(2)中處理后的酶解液中加入原生質(zhì)體釋放液，之后細(xì)胞篩過濾，低速離心，棄上清；

(4)向步驟(3)中保留的溶液中加入原生質(zhì)體釋放液，重新懸浮原生質(zhì)體，細(xì)胞篩過濾，低溫低速離心，棄上清，加入原生質(zhì)體釋放液重新懸浮原生質(zhì)體；

(5)將步驟(4)中獲得的原生質(zhì)體置于冰上，重新懸浮原生質(zhì)體，取原生質(zhì)體懸浮液加入臺(tái)盼藍(lán)染色液在載玻片上通過顯微鏡鏡檢，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞活率；

在步驟(2)中，根尖組織所加入的酶解液的配方為：Cellulase?R10?1.5％、Pectolyase1％、D-甘露醇0.4mol/L、KCl?0.1mol/L、MES0.08mol/L、CaCl₂?0.02mol/L、BSA?0.1％，溶劑為滅菌的ddH₂O，根尖組織加入酶解液后，先進(jìn)行抽真空，之后再進(jìn)行培養(yǎng)，抽真空的時(shí)間為30min-1h，培養(yǎng)為在25℃，以80-120r/min培養(yǎng)5-7h；

在步驟(2)中，葉肉組織所加入的酶解液的配方為Cellulase?R10?1.5％、Macerozyme0.75％、HemiCellulase?1％、D-甘露醇0.4mol/L、KCl?20mmol/L、MES20mmol/L、CaCl₂?10mmol/L、BSA?0.1％，溶劑為滅菌的ddH₂O，培養(yǎng)為在25℃，以80-120r/min培養(yǎng)4-6h；

在步驟(3)中，根尖組織所用的原生質(zhì)體釋放液的配方為：KCl0.1mol/L、BSA?0.1％、MES?0.08mol/L、D-甘露醇0.4mol/L，溶劑為滅菌的ddH₂O；葉肉組織所用的原生質(zhì)體釋放液的配方為：KCl5mmol/L、NaCl154mmol/L、MES?20mmol/L，溶劑為滅菌的ddH₂O；MES的pH值為5.7。

2.如權(quán)利要求1所述的解離方法，其特征在于，

在步驟(1)中，獲得亞洲棉的根尖組織的方法：取飽滿的亞洲棉種子，采用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行萌發(fā)生長；側(cè)根生長至2-3cm時(shí)取樣，取距離根尖0.5-1cm處組織；

獲得葉肉組織的方法：取飽滿的亞洲棉種子，植入營養(yǎng)土中黑暗條件下萌發(fā)、正常光照下生長；生長至子葉完全平展時(shí)取樣，將子葉切成0.5-1mm的細(xì)條。

3.如權(quán)利要求2所述的解離方法，其特征在于，

所述正常光照下生長條件為28℃恒溫，16h光照/8h黑暗。

4.如權(quán)利要求1所述的解離方法，其特征在于，

根尖組織所用的低速離心為：離心速度為300g，且加減速設(shè)為1，離心時(shí)間10min。

5.如權(quán)利要求1所述的解離方法，其特征在于，

葉肉組織所用的低溫低速離心為：溫度為4℃，離心速度為30g，且加減速設(shè)為2，離心時(shí)間10min。

6.如權(quán)利要求1所述的解離方法，其特征在于，

細(xì)胞篩的孔徑為40μm；

步驟(5)中，所述臺(tái)盼藍(lán)染色液的質(zhì)量濃度為0.4％；鏡檢時(shí)原生質(zhì)體懸浮液與臺(tái)盼藍(lán)染色液的比例為5：1。