[發明專利]木聚糖酶突變體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202110178825.2
• 申請日: 2021-02-07
• 公開（公告）號: CN112708608B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 游帥;張溫馨;查子千;謝晨;葛研;胡洋浩;王俊
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/14;A23K20/189;C12R1/84
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 王穎

本發明公開了一種木聚糖酶突變體及其制備方法與應用，涉及基因工程和遺傳工程技術領域。該突變體包括以木聚糖酶HwXyl10A為母本對Gly363位點飽和突變后得到的一種或幾種突變體。具體通過定點突變得到了19種突變體，對其進行酵母表達，再通過熱穩定新和催化活力篩選，獲得2個比活力和熱穩定性均顯著提高的突變體；本發明通過對Gly363位點的改造可以大大提高木聚糖酶的熱穩定新和催化效率，并對第10家族木聚糖酶及其它糖苷水解酶的熱穩定性和催化效率改良具有重要的指導意義，還為其在工業生產中的應用提供了基礎。

技術領域

本發明涉及基因工程和遺傳工程技術領域，涉及一種木聚糖酶突變體及其制備方法與應用，特別是涉及一種高比活耐熱木聚糖酶突變體及其制備方法與應用。

背景技術

自然界中50％以上的生物量由纖維素、半纖維素、木質素和果膠等成分組成。木聚糖是半纖維素的主要組成成分之一，是自然界中含量僅次于纖維素的可再生資源，約占地球可再生有機碳的1/3。木聚糖的結構比較復雜，主鏈是由吡喃木糖以β-D-1,4-木糖苷鍵連接而成，側鏈成分多樣，主要包括阿魏酸、α-L-阿拉伯呋喃糖殘基、O–乙?；?、香豆酸和葡萄糖醛酸殘基等，因此木聚糖的水解需要多種酶的共同參與。

木聚糖酶是水解木聚糖的關鍵酶，它可以切割木聚糖主鏈的β-1，4-糖苷鍵產生小寡糖或者單糖。木聚糖的應用十分廣泛，主要包括動物飼料、食品、造紙、啤酒釀造以及綠色能源等領域。木聚糖酶在5、7、8、10、11、16、26、30、43、52和62等11個糖苷水解酶家族(GH)中都有分布，其中GH10和GH11家族的木聚糖酶研究最多，GH10家族木聚糖酶屬于(β/α)8–barrel結構，其分子量較GH11家族木聚糖酶高，穩定性強且底物譜廣。大部分微生物來源的GH10家族木聚糖酶都在中溫(大約40到60℃)中性或者微酸性環境表現出最大活力。在工業應用中，大多數應用環境都屬于高溫環境，因此獲得熱穩定性優良且催化活力高的木聚糖酶對工業生產至關重要，目前已經有53個真菌來源木聚糖酶的晶體結構被解析，這為木聚糖酶的性質改良打下了基礎。

目前，蛋白質工程在酶分子改良方面應用廣泛，即通過對基因或者蛋白本身進行修改或修飾以改變蛋白分子結構從而實現酶功能的改造。蛋白質工程主要用于酶的熱穩定性、催化效率、底物特異性和極端環境耐受性等酶學性質的設計和改造。主要涉及的方法有定向進化、理性設計和半理性設計。其中理性設計是一種快速且有效的改造手段，其對蛋白分子結構準確性要求較高。理性設計中常用的方法主要有模塊替換和定點突變。如通過該方法，Thermoascus aurantiacus來源的木聚糖酶XynA的熱穩定性和pH穩定性得到顯著提升。定點飽和突變是理性設計中行之有效的改造方法，通過計算機模擬計算，篩選到與酶功能密切相關的氨基酸位點，對該位點進行飽和突變充分發揮關鍵氨基酸位點的作用潛力，獲得性質提升的突變體。而如何獲取更多種性能優越的木聚糖酶突變體，以豐富糖苷水解酶家族的木聚糖酶種類，滿足不同工業領域的需求，是亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種木聚糖酶突變體及其制備方法與應用，以解決上述現有技術存在的問題，通過對第10家族木聚糖酶HwXyl10A關鍵氨基酸位點Gly363飽和突變后篩選得到的突變體，具體得到2種熱穩定性和催化效率大幅度提高的木聚糖酶突變體，對于應用到飼料和利用生物質降解木聚糖產糖產業中具有廣闊的前景。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種高比活耐熱木聚糖酶突變體，包括以木聚糖酶HwXyl10A為母本對Gly363位點飽和突變后得到的一種或幾種突變體。

優選的是，以木聚糖酶HwXyl10A為母本對Gly363位點飽和突變后得到2種高比活耐熱木聚糖酶突變體HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K。

優選的是，所述HwXyl10A_G363R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述HwXyl10A_G363K的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。