[發明專利]禾谷縊管蚜實時熒光定量PCR檢測的內參基因及其擴增引物和應用

在審

• 申請號: 202110178176.6
• 申請日: 2021-02-09
• 公開（公告）號: CN112746115A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 朱勛;李孟奕;楊峰山;張云慧;李祥瑞;李新安;龔培盼;王超;李秋池;朱賽格;殷新田
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了禾谷縊管蚜實時熒光定量PCR檢測用的內參基因及其擴增引物和應用。本發明利用熒光定量PCR技術建立了禾谷縊管蚜在不同試驗條件下內參基因的篩選方法，最終篩選出EF?1α、β?actin、AK、TATA、GAPDH、GST、RPL13、RPS6、RPS18、18S或28S基因適宜作為禾谷縊管蚜實時熒光定量PCR檢測用的內參基因。本發明進一步設計擴增所述內參基因的特異性定量引物，建立基于SYBR Green I染料技術的RT?PCR方法，為研究禾谷縊管蚜功能基因或不同發育時期、不同地理種群、不同身體部位、不同翅型基因表達或不同處理條件下基因表達提供了準確和靈敏的實時熒光定量PCR檢測方法。

技術領域

本發明涉及蚜科昆蟲內參基因的篩選，尤其涉及禾谷縊管蚜內參基因的篩選，本發明進一步涉及它們作為內參基因應用于禾谷縊管蚜不同發育階段、不同地理種群、不同身體部位、不同翅型以及不同處理條件下基因表達的實時熒光定量PCR檢測中的用途，屬于禾谷縊管蚜內參基因的篩選及應用領域。

背景技術

禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi(L.)屬半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，是重要的小麥害蟲之一，其廣泛分布于世界各小麥種植區。禾谷縊管蚜在中國各麥區均有分布，1980年以來是黃淮麥區和長江中下游麥區的重要害蟲，但近些年來，表現出成災區向北方擴散且逐漸加重的趨勢。目前，中國禾谷縊管蚜的防治仍以化學防治為主，但該蟲為典型的R-對策害蟲，具有個體小、內稟增長率高、世代周期短、繁殖率高、環境適應性強等多樣的適應機制，以及無性和有性生殖共存的繁殖方式，能夠快速的適應復雜多變的環境，即使遭遇惡劣的外界環境變化，如低溫、暴雨、農藥使用等導致其種群數量降低，但當環境條件適宜時，種群數量則能夠在短時間得以迅速恢復。隨著長年殺蟲劑的大量、不合理使用，已造成禾谷縊管蚜對多種、不同類型殺蟲劑敏感性下降，其抗藥性水平逐年上升，使得防治難度不斷增加。由于防治問題的存在，人們對麥蚜抗藥性問題日益關注，禾谷縊管蚜抗藥性的研究也日益深入。

在昆蟲基因轉錄水平的研究中，實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)是一種檢測特定基因mRNA表達水平和轉錄分析的有效手段。qRT-PCR技術具有實時檢測、特異性強、快速靈敏、準確定量的優點，實現了傳統PCR從定性到精準定量的飛躍。進行qRT-PCR試驗時，內參基因必須在給定的實驗條件下穩定表達。為促進基因表達研究，獲得更準確的表達量數據，篩選相對穩定的內參基因是必要的基礎工作。理想的內參基因要求不受外界任何環境因素影響，在不同實驗條件下均能穩定表達。但是，大量研究表明，不存在絕對穩定表達的基因(Zhu,X.,Yuan,M.,Shakeel,M.,Zhang,Y.,Wang,S.,Wang,X.,Zhan,S.,Kang,T.and Li,J.(2014)Selection and evaluation of reference genes for expression analysisusing qRT-PCR in the beet armyworm Spodoptera exigua(Hübner)(Lepidoptera:Noctuidae).PlOS ONE,9,e84730.)。

在昆蟲樣本體內，同一基因在不同種類昆蟲中的功能、表達水平存在差異。同樣，候選內參基因的表達情況也會因為不同昆蟲物種或不同實驗條件而存在差異。隨著qRT-PCR技術的廣泛應用，研究發現，昆蟲樣品種類和實驗條件的不同，持家基因的表達量在某些特定條件下會發生較大的變化，如果盲目地借鑒，可能影響最終定量結果的準確性。

發明內容

本發明的目的之一是提供禾谷縊管蚜的內參基因，尤其是提供禾谷縊管蚜不同發育階段，不同地理種群，不同身體部位，不同翅型以及不同處理條件下能夠進行穩定表達的內參基因。

本發明的目的之二提供擴增所述內參基因的特異性定量引物。

本發明的主要目的之三將應用所述的禾谷縊管蚜的內參基因以及特異性定量引物采用實時熒光定量PCR方法對于禾谷縊管蚜不同發育階段，不同地理種群，不同身體部位穩定，不同翅型或不同處理條件下基因表達進行實時熒光定量PCR分析。