[發明專利]一種檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法

在審

• 申請號: 202110176808.5
• 申請日: 2021-02-09
• 公開（公告）號: CN113025712A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 賀宇飛;王紅陽
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 孫躍虹

本發明涉及生物技術領域，具體是一種檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法及臨床應用。本發明發現，與癌旁組織相比，盡管肝癌組織中存在廣泛的遺傳和表觀遺傳變化，但肝癌組織中的肝癌干細胞只存在少量但關鍵的遺傳和表觀遺傳變化。針對這些腫瘤干細胞中發生的關鍵的遺傳和表觀遺傳變化的治療，對癌癥的治療效果可能會更好。本發明為肝癌的治療提供了新的靶標發現方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，是一種檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法及臨床應用。

背景技術

腫瘤干細胞(CSC)在腫瘤細胞群中占比非常少，但它在腫瘤發生中起關鍵作用。腫瘤生物學中的一個基本問題是CSC中發生了哪些遺傳和表觀遺傳變化，以及這些變化是否與該腫瘤的其他腫瘤實質細胞中的變化相似。

癌癥發生是一個復雜的進化的過程，目前我們知道，與正常細胞相比，腫瘤細胞中發生了許多多種原因導致的顯著的遺傳和表觀遺傳變化。很多癌癥被認為起源于CSC，它們帶來了腫瘤治療的耐藥性和復發的高風險。了解人類CSC的遺傳和表觀遺傳學變化可為設計新的、更好的癌癥治療方法提供啟發。但是，研究人類CSC總是很困難，因為它們通常只占臨床患者腫瘤標本的很小一部分。因此，人們對人類CSC中發生的遺傳和表觀遺傳學變化以及這些變化是否與該腫瘤的其它腫瘤實質細胞一樣，仍知之甚少。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法及臨床應用，適用于稀少CSC的研究，尤其是考慮到空間異質性時。

為了實現上述目的，本發明提供一種檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法(CIL-seq)，包括：

(A)免疫組織化學(IHC)方法處理腫瘤組織；

(B)激光捕獲顯微切割(LCM)方法捕獲所需細胞；

(C)單細胞測序技術分析人類腫瘤干細胞(CSC)的少量但關鍵的遺傳和表觀遺傳變化。

進一步的，所述的腫瘤為肝癌。但是本發明的方法也可以應用于除了肝癌之外的其它類型癌癥的研究，如肝癌、肺癌、胃癌、結直腸癌、腦膠質瘤、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、淋巴瘤、宮頸癌、頭頸鱗癌、皮膚癌等實體瘤。

進一步的，所述的步驟A免疫組織化學(IHC)方法中對腫瘤組織采用冷凍切片的處理方法。為了更好地獲得肝癌干細胞(LCSC)供進一步研究，我們對冷凍切片進行了EpCAMIHC染色。但是本發明的方法也可以應用于石蠟包埋腫瘤組織切片的研究。

進一步的，所述的步驟B采用激光捕獲顯微切割(LCM)方法在多個空間區域中更精確，更直觀地捕獲所需細胞，這有助于研究腫瘤生物學和異質性。

進一步的，所述的步驟C采用全外顯子測序(WES)分析人類腫瘤干細胞(CSC)的關鍵遺傳變化，采用全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)分析人類腫瘤干細胞(CSC)的少量的關鍵表觀遺傳變化。更進一步的，所述的人類腫瘤干細胞(CSC)的少量的關鍵表觀遺傳變化為DNA甲基化變化。

為了測試IHC過程是否會破壞基因組DNA的完整性，我們分別選取了約40個聚在一起的同類型的純的一團細胞(HCC細胞或癌旁肝實質細胞(PL)，進行基于單細胞技術的WGS建庫分析。幾個相同類型細胞的同時測序可以盡可能減少由單細胞的全基因組擴增引起的固有的單堿基假陽性。

更進一步的，所述的檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法(CIL-seq)，包括以下步驟：

a)免疫組織化學(IHC)和激光捕獲顯微切割(LCM)：