[發明專利]一種檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法

在審

• 申請號: 202110176808.5
• 申請日: 2021-02-09
• 公開（公告）號: CN113025712A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 賀宇飛;王紅陽
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 孫躍虹

1.一種檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(A)免疫組織化學方法處理腫瘤組織；

(B)激光捕獲顯微切割方法捕獲所需細胞；

(C)單細胞測序技術分析人類腫瘤干細胞的少量但關鍵的遺傳和表觀遺傳變化。

2.根據權利要求1所述的檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法，其特征在于，所述的腫瘤為肝癌、肺癌、胃癌、結直腸癌、腦膠質瘤、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、淋巴瘤、宮頸癌、頭頸鱗癌、皮膚癌。

3.根據權利要求1所述的檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法，其特征在于，所述的步驟A免疫組織化學方法中對腫瘤組織采用冷凍切片或石蠟包埋切片的處理方法。

4.根據權利要求1所述的檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法，其特征在于，所述的步驟C采用全外顯子測序分析人類腫瘤干細胞的關鍵遺傳變化，采用全基因組亞硫酸氫鹽測序分析人類腫瘤干細胞的少量的關鍵表觀遺傳變化。

5.根據權利要求4所述的檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法，其特征在于，所述的人類腫瘤干細胞的少量的關鍵表觀遺傳變化為DNA甲基化變化。

6.根據權利要求1所述的檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)免疫組織化學和激光捕獲顯微切割：

將OCT包埋的冷凍腫瘤組織和癌旁組織切成10μm厚的切片，然后貼在PEN膜載玻片上；EpCAM的IHC后，通過在50ml無菌離心管中增加乙醇濃度使組織脫水，分別為50、75、85、95、100和100％乙醇，每次60s；當膜片完全干燥后，用Leica LMD 7000激光顯微切割系統啟動LCM程序；所有捕獲的樣品收集在0.2ml PCR管中；最后，膜片經過二甲苯透明，封片后長期保存；

b)遺傳文庫：

通過Quick-DNA Microprep Plus試劑盒從LCM樣品中提取超低DNA，然后使用REPLI-g單細胞試劑盒，基于單細胞多重置換擴增技術，對微量DNA進行擴增；獲得高質量的全基因組DNA擴增產物后，使用Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進行全基因組外顯子捕獲和文庫構建；全基因組文庫由QIAseq FX單細胞DNA文庫試劑盒構建；

c)全基因組亞硫酸氫鹽測序文庫：

利用EZ DNA甲基化直接試劑盒，用1mg/ml蛋白酶K將LCM的組織樣品消化長達4小時；徹底消化后，將顯微切割收集的細胞立即用Pico Methyl-Seq文庫制備試劑盒，進行超低量DNA文庫的構建，并稍作調整：將亞硫酸氫鹽轉化時間延長至90分鐘以確保完全轉化；對于M1BULK樣品，該文庫在第4步驟中僅需要6個循環，而其他文庫則需要11個循環；

d)測序：

所有文庫均使用Illumina Xten平臺進行測序，產生150bp雙端reads；

e)采用全外顯子測序分析人類腫瘤干細胞的關鍵遺傳變化，采用全基因組亞硫酸氫鹽測序分析人類腫瘤干細胞的少量的關鍵表觀遺傳變化；所述的人類腫瘤干細胞的少量的關鍵表觀遺傳變化為DNA甲基化變化。

7.根據權利要求6所述的檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法，其特征在于，包括以下步驟：所述的步驟e中采用全外顯子測序比較腫瘤干細胞、腫瘤實質細胞、癌旁細胞的關鍵遺傳變化。

8.根據權利要求6所述的檢測腫瘤干細胞中遺傳和表觀遺傳變化的方法，其特征在于，包括以下步驟：所述的步驟e中采用全基因組亞硫酸氫鹽測序比較腫瘤干細胞、腫瘤實質細胞、癌旁細胞的DNA甲基化變化。