[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)菜油甾醇的釀酒酵母工程菌及構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110176165.4
• 申請日: 2021-02-06
• 公開（公告）號: CN112812983B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 饒志明;周武林;邵明龍;楊套偉;張顯;徐美娟
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/90;C12N15/53;C12N15/55;C12P33/00;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)菜油甾醇的釀酒酵母工程菌及構(gòu)建方法，屬于基因工程和生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過將7?脫氫膽固醇還原酶的表達(dá)盒元件導(dǎo)入到酵母細(xì)胞體內(nèi)，利用CRISPR/Cas9基因操作系統(tǒng)整合至酵母基因組中，還敲除了C?22甾醇去飽和酶，解除麥角固醇分支途徑的競爭，實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到菜油甾醇的酵母合成。本發(fā)明的方法工藝簡單，綠色環(huán)保，可用于發(fā)酵生產(chǎn)菜油甾醇。采用本發(fā)明提供釀酒酵母工程菌株BY4742?Δerg5?TEF1p?dhcr7?ADH1t制備得到的菜油甾醇的產(chǎn)量，在搖瓶階段可達(dá)253.35mg/L，發(fā)酵罐水平產(chǎn)量可達(dá)916.88mg/L，比菌株在搖瓶階段菜油甾醇的產(chǎn)量提升了2.6倍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)菜油甾醇的釀酒酵母工程菌及構(gòu)建方法，屬于基因工程和生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來，甾體藥物因具備良好的抗炎、抗過敏和避孕等作用而備受生物醫(yī)藥行業(yè)的高度重視，甾體激素類藥物的市場需求一直居高不下，成為僅次于抗生素的第二大藥物。隨著人們對甾體激素類藥物的需求不斷增加，全球甾體激素藥物的生產(chǎn)工藝經(jīng)歷了數(shù)次變革，包括化學(xué)全合成、植物提取皂素加化學(xué)半合成、新型微生物合成等多個階段，直至今日，甾體激素藥物的合成工藝仍在不斷探索與創(chuàng)新。菜油甾醇是甾體藥物(孕酮、雄烯二酮、氫化可的松等)的一種重要合成前體，也是植物來源的主要甾醇之一。其與動物來源的主要甾醇(膽固醇)的結(jié)構(gòu)僅在C24位多出一個甲基，與微生物來源的主要甾醇(麥角甾醇)的區(qū)別在于C7-8和C22-23位是飽和單鍵。因此，這為微生物催化法生產(chǎn)菜油甾醇提供了可行性的理論基礎(chǔ)。

目前，甾體類藥物主要通過化學(xué)合成和生物催化兩種主要方式進(jìn)行生產(chǎn)。由于化學(xué)合成法會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染且中間步驟復(fù)雜，因此，生物催化因其綠色環(huán)保且反應(yīng)過程簡易而受到了極大的關(guān)注。然而，由于甾體類藥物及其中間體水溶性較差，難以進(jìn)出細(xì)胞被利用，造成了生物催化生產(chǎn)甾體類藥物的較低生物轉(zhuǎn)化率。雖然有添加助溶劑以及將底物溶解于有機(jī)溶劑中進(jìn)行添加等方法來提高微生物對底物的利用率，但轉(zhuǎn)化率仍然不是很高。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，利用微生物合成菜油甾醇等具有高價值藥物的前體化合物已成為一種發(fā)展趨勢。微生物合成具有周期短，產(chǎn)量高，條件溫和，環(huán)保和過程可控等特點(diǎn)，因此可作為新型的生產(chǎn)甾體藥物的生產(chǎn)方式。

酵母細(xì)胞體內(nèi)存在著一條天然的甾醇合成途徑，因此可作為合成甾體藥物的優(yōu)良底盤細(xì)胞。現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)中，雖然存在采用酵母細(xì)胞生產(chǎn)菜油甾醇的報道，但是，由于途徑中(如圖3所示)的關(guān)鍵酶7脫氫膽固醇還原酶DHCR7的活性不高，進(jìn)而限制了菜油甾醇的高效生產(chǎn)。因此，如何得到一種高效生產(chǎn)菜油甾醇的方法，成為研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種高效生產(chǎn)菜油甾醇的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法，及利用釀酒酵母工程菌高效生產(chǎn)菜油甾醇的方法。

技術(shù)方案

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種釀酒酵母工程菌，所述釀酒酵母工程菌敲除了C-22甾醇去飽和酶Erg5，并且含有來源于Pangasianodon hypophthalmus的7-脫氫膽固醇還原酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述7-脫氫膽固醇還原酶的氨基酸序列如SEQ IDNO 1所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述7-脫氫膽固醇還原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO 2所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述C-22甾醇去飽和酶基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 3所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述C-22甾醇去飽和酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 4所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母工程菌以釀酒酵母BY4742為宿主細(xì)胞。